III. Биологическое действие ионизирующего излучения

 

§1 Прямое и косвенное действие ионизирующего излучения

 

В процессах взаимодействия ио­низирующих излучений с веществом энергия излучений передается атомам и молекулам окру­жающей среды, в том числе клеток, тканей организмов. На следующим за этим физическим этапом химическим этапом лучевого поражения клетки происходят  первичные радиационно-химические изменения молекул. Различают два механизма, обозначаемые как прямое и косвенное действие радиации.

Под прямым действием понимают такие изменения, которые возни­кают в результате поглощения энер­гии излучения самими исследуемы­ми молекулами («мишенями»). Под косвенным действием понимают изменения молекул в растворе, вызванные продуктами радиационного разложения (радиолиза) воды или растворенных веществ, а не энергией излучения, поглощенной самими исследуемыми молекулами (рис. III.1).

При косвенном действии наиболее существен процесс радиолиза воды, составляющей основную массу (до 90 %) вещества в клетках. При радиолизе воды молекула ионизируется заряженной частицей, те­ряя при этом электрон:

H2OH2O+ + е-

Ионизированная молекула воды реагирует с другой нейтральной молекулой воды, в результате чего образуется высоко реактивный радикал гидроксила ОН'

H2O+ + H2OH2O+ + ОН'

 «Вырванный» электрон очень быстро взаимодействует с окружающими молекулами воды; возникает сильно возбужденная молекула H2О*, которая, в свою очередь, диссоциирует с образованием двух радикалов: Н’ и ОН'

H2O+ + е-H2О*→ Н’ + ОН'

Эти свободные радикалы содержат неспаренные электроны и потому отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью. Время их жизни в воде не более 10-5 с. За этот период они либо ре комбинируют друг с другом, либо реагируют с растворенным субстратом. Сле­довательно, и второй этап радиационного поражения — первичные хи­мические изменения — протекает практически мгновенно.


 

Рис. III.1. Прямое (/) и косвенное (//) действия ионизирующего излучения на клетку:

черным кружком обозначена мишень, волнистой стрелкой — излучение, пунктир­ной стрелкой — диффузия свободных ра­дикалов к молекуле-мишени

 

      

Рис. III.2. Продукты радиолиза воды:

тонкими стрелками показаны возможные реакции гидратироваиного электрона

 

В присутствии кислорода образуются и другие продукты радиолиза, обладающие окислительными свойствами: гидропероксидный радикал  пероксид водорода H2O2 и атомарный кислород:

Кроме этих окислительных продуктов в процессе радиолиза воды возникает стабилизированная форма электрона — гидратированные электроны (e-·aq). Они также обладают высокой реакционной способ­ностью, но уже в качестве восстановителя, а потому реагируют с про­дуктами радиолиза и другими легко восстанавливающимися вещества­ми, в частности с дисульфидными группами. Другим восстановителем, образующимся в процессе радиолиза воды, является атомарный водо­род. Процесс радиолиза воды схематически представлен на рис. III.2.

В клетке организма в аналогичной ситуации процесс протекает зна­чительно сложнее, чем при облучении воды, так как поглощающим ве­ществом здесь служат крупные органические молекулы, повреждае­мые прямым действием радиации либо продуктами радиолиза воды. Возникающие при этом органические радикалы также обладают не спаренными электронами, а, следовательно, крайне реакционноспособны. Располагая большим количеством энергии, они легко могут привести к разрыву химических связей в жизненно важных макромолекулах. Именно этот процесс и происходит чаще всего в промежутке между образованием ионных пар и формированием конечных химиче­ских продуктов.

Кроме того, биологический эффект облучения усиливается за счет кислорода, который всегда присутствует в среде и обладает сенсибили­зирующим действием (см. ниже).

Упрощенная схема первичных физико-химических процессов, при­водящих в финале к конечному биологическому эффекту, выглядит следующим образом

 

Следует иметь в виду, что изменения облучаемого субстрата в клет­ке, возникающие на каждом из этапов, не всегда являются оконча­тельными. Как правило, эти изменения на молекулярном уровне но­сят промежуточный характер, и конечный результат в каждом конкрет­ном случае не может быть предсказан, так как наряду с повреждением может произойти и репарация (восстановление) исходного состояния.

Для растворов ферментов установ­лено, что при заданной дозе облучения абсолютное число инактивированных молекул не зависит от их концентрации, так как в системе об­разуется постоянное для данной дозы количество способных про­реагировать водных радикалов.

При косвен­ном действии независимо от разведения раствора абсолют­ное число поврежденных молекул остается постоянным, а доля их от общего числа изменяется обратно пропорцио­нально их концентрации.

В отличие от косвенного, при прямом действии число инактивированных молекул при заданной дозе увеличивается пропорцио­нально концентрации раствора, а доля от общего числа молекул остается постоянной (рис. III.3).

 

 

 

Рис. III.3. «Эффект разведения» (А, Б). Зависимость степени инактивации фермента или вируса от концентрации его в рас­творе при прямом (I) и косвенном (II) действии излучения (по 3. Баку, П. Александеру)

 

Эффект разведения оказался весьма существенным для различ­ных систем in vitro, таких, как растворы макромолекул, вирусов, фагов и т. д. Однако он неприменим при работе с крупными клетками: при разбавлении суспензии величина повреждающей дозы не уменьшает­ся. Из этого не следует, что действие излучения на клетки оказывается прямым, так как разведение не затрагивает содержимого клеток, а сводится лишь к увеличению между ними количества воды, радикалы второй прореагировали между собой, не проникнув в клетку на доста­точную глубину.

Между первичным поглощением энергии и конечным химическим изменением облучаемого субстрата существует много стадий, на каждой из которых, как упоминалось, возможна реверсия.

Следовательно, для клетки пока не известна корректная возмож­ность, непосредственно оценить относительную роль прямого и косвенного действия ионизирующих излучений.

Данные некоторых экспериментов на вирусах позволяют предпола­гать, что при облучении клеток прямое действие играет если не основ­ную, то, во всяком случае, весьма существенную роль. В пользу этого вывода приводят два довода.

Косвенное действие при облучении раствора ДНК проявляется при ее содержании менее 2 %, тогда как в ядре клетки ДНК составляет 10 % и более.                                                 

При облучении in vivo появление одного и того же количества повреждений молекул ДНК наблюдается при дозах, на два-три поряд­ка превышающих те, которые вызывают повреждение этих молекул при облучении в разбавленных растворах. Снижение эффективности облучения in vivo объясняют тем, что большая часть продуктов радио­лиза воды поглощается клеточными метаболитами и не доходит до биологически активных макромолекул, иначе говоря, имеет место защит­ное действие примесей. Так, например, трансформирующая способ­ность ДНК пневмококков, экстрагированной после их облучения, не изменялась даже при дозе 1000 Гр. Инактивирующая доза для сухих препаратов этой ДНК оказалась равной 700 Гр, а при облучении ДНК в разбавленном растворе инактивация трансформирующего фактора наблюдалась уже при дозе 10 Гр.

На основании этих данных можно было полагать, что явления, вызы­ваемые косвенным действием ионизирующего излучения, при инактивации ДНК играют незначительную роль. Однако недавно (1986) проведенный Ю. Н. Корыстовым анализ методов оценки вклада косвен­ного действия радиации в гибель клеток показал, что ни один из них не свободен от артефактов, искажающих оценку. При сведении этих артефактов к минимуму путем соблюдения оптимальных условий опыта, согласно оценкам автора, полный вклад косвенного действия дости­гает 90% и является определяющим в инактивации клетки ионизи­рующим излучением.

Тем не менее, крайние точки зрения относительно преобладания прямого или косвенного действия радиации на ДНК в составе клеток вряд ли можно считать однозначными и общими для всех видов клеток.

 

Что понимают под прямым и косвенным действием излучения?

Назовите первичные радиационно-химическне процессы, возникающие в облученных растворах.

Какова относительная роль прямого и косвенного действия излучения в лучевом поражении клетки?

 

§2 Реакция клетки на облучение. Клеточная радиочувствительность

 

В результате облучения, повреждающего абсолютно все внутриклеточные структуры, в клетке можно зарегистрировать множество самых разнообразных реакций — задержку деления, угнетение синтеза ДНК, повреждение мембран и др. Степень выраженности этих реакций зависит от того, на какой стадии жизненного цикла клетки произведено облучение.

Синтез ДНК в клетке происходит в интерфазе, занимая в ней определенный промежуток времени. Это позволило разделить ннтерфазу на три периода — период синтеза ДНК (S-период), пред- и постсинтетические периоды (соот­ветственно G1 и G2) (От англ. Gap — интервал.)  Митоз, чет­вертый период цикла, обозначается буквой М. Продолжительность жиз­ненного, или митотического, цик­ла — время между двумя последова­тельными делениями клетки — сла­гается из отдельных стадий, дли­тельность которых в разных тканях варьирует относительно друг друга по величине, располагаясь, как пра­вило, следующим образом: М < G2 <S < G1 (рис. III.4).

 

 

Рис. III.4. Митотическнй цикл:

М - митоз,   G1 - предсннтетическнй   пе­риод, S - период синтеза ДНК, G2 - постсинтетический  период. G0 - фаза покоя (клетка может переходить в нее либо после завершения синтеза ДНК, либо по окончании митоза; в фазе покоя клетка находится до тех пор, пока некоторый стимул не побудит ее снова вступить в цикл соответственно в G2 - или G1 -периоды)

 

В  активно обновляющихся тканях (эпителий ворсинок кишеч­ника, костный мозг, кожа и др.), а также в быстрорастущих опу­холях и клеточных культурах продолжительность цикла составляет от 10 до 48 ч. Наиболее продолжительны периоды G1 и S, а самый кратковременный период — митоз — завершается в большинстве слу­чаев в течение 30 — 60 мин.

В малообновляющихся тканях большинство клеток находится в G1-периоде, длительность которого измеряется неделями, а иногда ме­сяцами и даже годами (например, в ЦНС), что в последнее время обус­ловило выделение еще одной стадии — G0; клетки, находящиеся на этой стадии, принято считать вне цикла, или покоящимися. Такие клет­ки составляют резерв репопуляции в случае гибели части клеточного пула от различных причин. Таков, например, механизм посттравмати­ческой регенерации тканей или возобновления роста опухо­ли после ее облучения.

Многие из лучевых реакций клетки легко переносятся клеткой, так как являются следствием повреждения множественных структур, утрата которых очень быстро восполняется или просто остается незамеченной. Такие преходящие клеточные реакции называют физиологическими или кумулятивными эффектами облучения. К ним относятся различные нарушения метаболизма, в том числе ингибирование нуклеинового обмена или окислительного фосфорилирования, слипание хромосом и др.

Как правило, подобные реакции проявляются в ближайшие сроки после облучения и с течением времени исчезают. Наиболее универсальная из них — временная задержка (угнетение) клеточного деления, часто называемая в литературе радиационным блокированием митозов. Снижение числа делящихся клеток после облучения было замечено уже вскоре после открытия рентгеновских лучей, что и послужило одним из оснований к применению этих лучей для подавления опухолевого роста. Эта реакция к настоящему времени наиболее хорошо изучена в количественном отношении на самых разнообразных объектах в экспериментах in vivo и in vitro для большого числа нормальных клеток и тканей, а также для опухолей человека и животных.


 

Рис. III.5. Динамика размножения клеток после облучения в разных до­зах. А и А' — икра вьюна; Б и Б' — яйца морского ежа; В и В' — поч­кование дрожжей (по В. И. Корогоднну, 1964):

A, А', 1 — необлученные зиготы. 2, 3, 4, 5—облученные (300 Гр) сперматозоиды, яйцеклетки, сперматозоиды и яйцеклетки до оплодотворения, зигота тотчас после оплодотворения соответственно:

Б, Б'.1 необлученные, 2, 3, 4—сперматозоиды, облученные непосредственно перед оплодотворением (1, 2, 10 Гр соответственно);

В, В',1 — необлученные. 2, 3 — облученные 160 н 180 Гр соответственно

 

Проведенные эксперименты показали, что длительность за­держки деления зависит от дозы ионизирующего  облучения и проявляется у всех клеток облученной популяции, независимо от дальнейшей судьбы той или иной клетки — выживет она или погибнет. Однако продолжитель­ность этого эффекта различна у разных объектов, что нагляд­но представлено на рис. III.5, где сведены и проанализированы результаты экспериментов ряда исследователей. Во всех случаях после облучения деление клеток дрожжей прекращалось и возоб­новлялось спустя некоторое вре­мя, различное у разных объек­тов, но всегда растущее с дозой облучения. У каждого из объек­тов кривые первого пострадиационного деления имеют почти такую же форму, как и кривые соот­ветствующих контрольных (необлученных) клеток, и лишь сдвинуты по оси абсцисс вправо. Это особенно хорошо видно при представлении данных в координатах «пробит-эффект — логарифм времени».

( Термин «пробит» происходит от англ. probability unit — вероятностная единица. Пробит-анализ — количественная оценка экспериментальных данных, основанная на изучении зависимости между логарифмами доз и пробитами, соответствующими наблюдавшимся эффектам. В этих координатах S-образные или, как их называют, сигмоидные кривые выпрямляются.)

 

 

 

Рис. III.6 Сдвиг максимума митотической активности клеток почки человека при облучении в S-периоде (по И. Скайф v, 1969);

стрелками показан сдвиг волны деления при соответствующей дозе облучения, Гр.

 

Многочисленные исследования показали, что для большинства изученных культур клеток задержка деления соответствует примерно 1 ч на каждый 1 Гр, т. е. около 0,6 мин на каждый сГр. Следовательно, эта реакция на облучение идентична у всех особей однородной популяции не только качественно, но и по величине, причем с увеличением дозы возрастает не доля реагирующих особей, а продолжительность задержки деления каждой облученной клетки. В этом состоит принципиальное отличие такого рода клеточных эффектов облучения от летальных поражений, анализ которых будет проведен ниже.

Время задержки деления клеток зависит и от стадии клеточного цикла, в которой находятся клетки при облучении; наиболее длительно оно в тех случаях, когда воздействию подвергаются клетки в стадии синтеза ДНК или в постсинтетической стадии, и самое короткое - при облучении в митозе, когда абсолютное большинство клеток, начав митоз, заканчивает его без задержки.

Из-за различий в длительности задержки деления, наблюдающейся на отдельных стадиях клеточного цикла, восстановление митотической активности при облучении активно пролиферирующих тканей происходит волнообразно, так как эти ткани представляют собой асинхронную клеточную популяцию, т. е. состоящую из клеток, находящихся на разных стадиях жизненного цикла.

Из рис. III.7 видно, что через 4 ч после облучения клеточное деление еще сильно подавлено, степень угнетения пропорциональна дозе. Восстановление митотической активности клетки происходит волнообразно, причем картина при всех использованных видах ионизирующих излучений однотипна.

Вскоре после первоначального падения митотический индекс достаточно резко повышается, иногда даже достигая исходного уровня, а затем вновь снижается. Это начальное повышение еще не является истинным увеличением количества митозов. Объяснением этому служит тот факт, что под влиянием облучения некоторые клетки запаздывают со вступлением в деление, что отражается в снижении митотического индекса сразу после облучения. Вероятно, эти клетки в момент облучения находились на наиболее чувствительной к излучению (по данному критерию) стадии интерфазы. Затем они начинают делиться, причем одновременно с клетками, которые к моменту облучения находились на менее чувствительной стадии, и потому вступили в митоз в обычное время. Так образуется компенсаторная волна увеличения митотического индекса, которая иногда может превышать исходные показатели. С увеличением дозы облучения и компенсаторная волна, и новое значение митотического индекса еще долго оказываются меньшими по сравнению с исходными, что объясняется подавлением способностей клеток к делению.

 

Рис. III.7 Динамика митотической активности костного мозга мышей после общего облучения.

Цифрами у начала кривых обозначены дозы облучения

 

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о роли радиационного повреждения ядра (большей, чем цитоплазмы) в механизме угнетения клеточного деления; в то же время установлено, что оно не связано с повреждением хромосом.                                                  

Можно рассматривать задержку деления как проявление неспецифического компонента реакции клеток на облуче­ние (тем более что она наблюдается в ответ на действие многих внешних факторов), имеющее защитно-приспособительный характер.

( Американский цитолог Д. Мэзия в предисловии к монографии, посвящен­ной физиологии клеточного деления, справедливо заметил, что «...обобщения дают возможность улавливать доказательства существования некоего общего плана (иными словами, осмысленности явления), которые может поставить нам природа».)

Суждение о защитном характере задержки митозов основано на том, что продолжительность задержки отражает меру восстановления клеток от вызванных излучением поражений, например, путем разрушения гипотетических токсинов или ресинтеза метаболитов, необходимых для деления. В этом случае следовало бы ожидать, что чем больше времени есть у клетки для восстановления, тем вероятнее, что она успешно раз­делится и даст жизнеспособное потомство. Однако прямые наблюдения показали, что степень задержки митозов одинакова как для гибнущих, так и для сохранивших жизнеспособность клеток. Отсутствие связи между задержкой деления и гибелью клетки подтверждается и данными о разной величине ОБЭ для этих феноменов (И. Скайф, 1969), и разнонаправленным изменением радиочувствительности и задержки деления по стадиям цикла.                                      

До сих пор нет достаточных данных для того, чтобы однозначно отнести задержку деления к проявлениям радиационного повреждения множественных внутриклеточных структур или оценить ее как защитную реакцию клеток на их повреждение;

Все сказанное относится к временной задержке первого пострадиационного деления, наблюдаемой после облучения в определенном, хоти и достаточно большом диапазоне доз (для большинства клеток млекопитающих в пределах 10 Гр). Еще менее изучен механизм задержки деления при повторных облучениях, а потому и более затруднена интерпретация.

Описываемую реакцию задержки деления следует отличать от полного подавления митоза, наступающего после воздействия больших доз, когда клетка значительное время продолжает жизнь, но необратимо утрачивает способность к делению. В результате такой необратимой реакции на облучение часто образуются патологические формы гигант­ских клеток, иногда даже содержащие несколько наборов хромосом вследствие их редупликации в пределах одной и той же не разделившейся клетки (эндомитоз).

Среди многих проявлений действия излучения на жизнедеятельность клетки подавление способности к делению явля­ется наиболее важным. В связи с этим под клеточной гибелью, или ле­тальным эффектом облучения, в радиобиологии понимают утрату клеткой способности к пролиферации. Наоборот, выжившими клетка­ми считают те, которые сохранили способность к неограниченному размножению, т. е. к клонообразованию. Таким образом, речь идет здесь о репродуктивной гибели клеток. Репродуктивная форма луче­вой инактивации клеток наиболее распространена в природе, Она же и лучше изучена методами количественной радиобиологии в связи с тем, что ее можно наблюдать при культивировании клеток вне орга­низма.

При наблюдении за облученными клетками линии L (мышиных фибробластов) было установлено, что их гибель происходит как в про­цессе 1-го пострадиационного деления, так и во 2-м, 3-м и 4-м митозах. На рис. 17 схематически показана судьба потомков одной клетки, облученной в дозе 2 Гр. Их гибель (фрагментация) наблюдалась толь­ко через 70 и 140 ч после облучения исходной клетки, т.е. соответственно после 2-го и 3-го деления. После облучения в дозе 4 Гр клетки линии L более чем в 80% случаев успешно заканчивали 1-е пострадиационное деление, но зато вероятность деления дочерних клеток (1-я генерация) и «внучек» (2-я генерация) составляла около 30%; остальные 70 % клеток, начав деление, погибали.

Другая разновидность репродуктивной гибели потомков облученных клеток — формирование так называемых гигантских клеток возникающих в результате слияния двух соседних, чаще «сестринских» клеток. Такие клетки способны не более чем к 2—3 делениям, после чего они погибают. Гигантские клетки могут возникнуть без слияния при длительной задержке истинного деления (эндомитоз) облученных клеток или их потомков. Такие клетки также нежизнеспособны.

Какие же реакции приводят делящиеся и малодифференцированные клетки к гибели? Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения ДНК, возникающие под влиянием облучения. Они легко обнаруживаются, в частности, цитологическими методами в виде так называемых хромосомных перестроек или аберраций хромосом. При этом разорванные хромосомы могут соединяться неправильно, а очень часто отдельные фрагменты их просто теряются при делении. Возникающие хромосомные перестройки весьма разнообразны. Отметим лишь основные виды аберраций: фрагментация хромосом, формирование хромосомных мостов, дицентриков, кольцевых хромосом, появление внутри- и меж хромосомных обменов и т.п. Часть аберраций, как, например, мосты, механически препятствует делению клетки; появление обменов и ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению хромосом и утрате генетического материала, вызывающей гибель клетки из-за нехватки метаболитов, синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы.

 

 

Рис. III.8. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облучен­ной на 5-стадии (по К. tpottv, 1969):

1 — гибель клетки. 2 — слияние двух кле­ток с образованием гигантской клетки

 

Долю клеток с хромосомными перестройками часто используют в качестве количественного показателя радиочувствительности, так как, с одной стороны, число таких перестроек четко зависит от дозы облуче­ния, а с другой — они, отражая летальное действие излучений, хоро­шо коррелируют с выживаемостью клеток.

Итак, рассмотренные виды лучевой инактивации клеток, насту­пающей после первого пострадиацнонного митоза и ведущей к прекращению клонобразования, называют репродуктивной или митотической формой гибели.

Другая форма радиационной инактивации клеток — интер­фазная гибель — наступает до вступления клетки в митоз. При очень больших дозах облучения это происходит непосредствен­но «под лучом» или вскоре после облучения. В диапазоне умерен­ных доз (до 10 Гр) гибель наступает в первые часы после облуче­ния и может быть зарегистрирована в виде различных дегенеративных изменений клетки; чаще всего под микроскопом через 2—6 ч можно наблюдать клетки с резким пикнозом ядра и фрагментацией хроматина.                             

Для размножающихся клеток в культуре ткани, а также для большинства клеток соматических тканей взрослых животных и человека интерфазная гибель регистрируется только после облучения при дозах в десятки и сотни грей. При меньших дозах наблюдается репродуктивная форма гибели, причиной которой, как упоминалось, в большинстве случаев являются структурные хромосомные повреждения.

Количественный метод определения выживаемости клеток, млеко­питающих после облучения впервые был разработан в 1956 г. Т. Паком и П. Маркусом для культуры клеток HeLa. Так как и по сей день он является основным методом, применяемым в количественной радио­биологии, будет подробно рассмотрен его первоначальный вариант, а также описаны некоторые дальнейшие его усовершенствования.

Клетки снимают со стенок культурального сосуда раствором трипсина или версена (рис. III.9), пипетируют до получения взвеси из строго одиночных клеток и рассеивают по чашкам Петри так, чтобы в каждую чашку попало заданное коли­чество клеток. На каждую дозу облучения и контроль берут по 5—8 чашек. После посева чашки с клетками облучают при нескольких дозах вплоть до 10— 20 Гр и выращивают в термостате 7—14 дней до получения видимых невооружен­ным глазом колоний, содержащих не менее 50 клеток. Следовательно, облучен­ная, но сохранившая жизнеспособность клетка и ее потомки должны совершить не менее шести последовательных делений. Выживаемость клеток при каждой до­зе облучения определяют как отношение числа колоний, выросших в облучен­ных чашках, к числу колоний, выросших в контроле (рис. III.9).

 

Рис. III.9. Техника клонирования кле­ток для определения их выживаемо­сти после облучения (по методу Т. Пака, Р. Маркуса):

/ — в две серии чашек Петри высевают одинаковое число клеток; //


 опытные чашки   облучают,   контрольные — нет;

///


 через 10—14 дней выжившие клетки делятся и образуют видимые колонии (клоны)

 

 

Полученная по такому методу кривая выживания растущих в куль­туре клеток опухоли Эрлиха (линии EL.D) приведена на рис. III.10.

 

Рис. III.10. Выживаемость клеток ELD при действии γ-излучения ('"Cs) в культуре:

точками показаны результаты отдельных экспериментов

 

В настоящее время радиобиологи имеют возмож­ность в эксперименте количественно оценивать радиочувствительность многих тканей и опухолей, сравнивая кривые выживания клеток после облучения (в том числе in vivo).

Существуют и другие критерии радиочувствительности, хорошо коррелирующие с выживаемостью, но прежде чем они будут описаны, необходимо остановиться на общем анализе кривых выживания.

 

Какова зависимость задержки деления клеток от дозы облучения?

Чем определяется волнообразный характер восстановления митотической активности после облучения активно пролиферирующнх тканей?

В чем состоит правило Бергонье и Трибондо?

Что понимают под летальным эффектом облучения клетки?

В чем отличие репродуктивной от интерфазной формы гибели?

Расскажите о методах оценки клеточной радиочувствнтельности, осно­ванных на изучении их способности к неограниченному размножению.

 

Кривые выживания самых различных клеток при действии рентге­новского, гамма- или любого другого редко ионизирующего излучения имеют форму, аналогичную приведенной на рис. III.10.

 

Рис. III.11.  Кривые выживания  клеток (кривые доза—эффект)  при действии плотно ионизирующего излучения. А — ли­нейные координаты; Б — полулогарифмические координаты:

пунктиром обозначена 37%-ная вы­живаемость

Рис. III.12 Основные параметры кривой выживания (объяснение см. в тексте)

 

В системе полулогарифмических координат (дозу облучения откладывают по шкале абсцисс в нелинейном масштабе, а выживаемость на оси ординат в логарифмическом) кривая состоит из так называемого плеча и линейного участка, начинающегося обычно после доз 3—5 Гр.

Для упрощения последующих рассуждений необходимо отметить, что при облучении клеток плотно ионизирующими частицами кривые их выживания не имеют плеча и в полулогарифмических координатах прямолинейны на всем своем протяжении (рис. III.11).

Такая зависимость хорошо описывается уравнением вида ,

где N — число выживших клеток из общего их числа, D любая доза облучения, D0 доза, при которой доля живых клеток уменьшается в сравнении с исходной в е раз: N/N0 = е-1 = 1/2,71 = 0,367. Таким образом, при дозе облучения, равной D0, выживает ~37%, а погиба­ет ~63 % клеток.

Величина D0 служит мерой радиочувствительности клеток и опреде­ляется по кривой выживания как доза, при которой выживает ~37 % клеток от исходного количества. Иногда поэтому ее называют D37, что в случае экспоненциальных кривых одно и то же, но для кривых, имеющих плечо, величины D0 и D37, различны (рис. III.10).

Графическое представление данных (см. рис. III.8 - III.10) определяет бытующее иногда представление о существовании некоей «критической дозы», при которой якобы погибают все клетки, так как экстраполяция кривой выживания в полуло­гарифмическом масштабе приводит к пересечению с осью абсцисс. На самом деле при возрастании дозы облучения фракция выживших клеток (или вероятность выживания) лишь асимптотически стремится к нулю.

Представление о критической дозе, однако, не лишено смысла: при облуче­нии ткани, где клетки находятся в близком контакте друг с другом, те из них, которые пережили облучение, могут погибнуть за счет автолиза и выхода фермен­тов из соседних клеток. Есть основания полагать, что снижение фракции выжив­ших клеток до Ю-6 — Ю-7 (при этом в 1 см3 остается от 100 до 1000 живых кле­ток) приводит к полной гибели всех клеток под действием других (не связанных с облучением) процессов, и соответствующая доза облучения может рассматри­ваться как критическая. Для клеток, не контактирующих друг с другом, на­пример находящихся в асцитной жидкости лейкозных клеток, представление о критической дозе неприменимо.

Кривые, имеющие плечо (см. рис. III.8, III.10), кроме величины D0, определяющей наклон ее линейного участка, характеризуются еще и так называемым экстраполяционным числом п. Оно опре­деляется в месте пересечения ординаты экстраполированным пря­молинейным участком кривой выживания. Здесь величина D0 определяется как инкремент (приращение) дозы, снижающей выживаемость в е раз на прямолинейном участке кривой выжи­вания.

Мерой способности клеток к репарации является величина плеча, оцениваемая квазипороговой дозой Dq. Она измеряется длиной отрезка прямой, параллельной оси абсцисс, проведенной на уровне 100%-ной выживаемости от оси ординат до точки пере­сечения с экстраполированным участком кривой выживания (см. рис. III.10).

Летальные реакции клеток имеют специфиче­скую особенность, отличающую их от рассмотренных выше обратимых преходящих клеточных эффектов.

Эта особенность состоит в том, что с увеличением дозы облучения увеличивается не только (и даже не столько) степень поражения всех облученных клеток, как это имеет место, например, в отноше­нии задержки деления, сколько доля пораженных, т. е. погиб­ших, клеток. Иными словами, с одной стороны, даже при самых малых дозах может быть зарегистрирован экстремальный эффект - гибель клетки (разумеется, с малой вероятностью), с другой - и при очень больших дозах (опять же с малой вероятностью) могут сохраниться отдельные жизнеспособные клетки.

Одним из часто используемых количественных методов оценки летального поражения пролиферирующих клеток служит подсчет числа клеток с аберрациями хромосом.

Согласно данным метафазного анализа (табл. III.1) существует полный параллелизм в изменении выживаемости клеток и долей безаберрантных клеток при облучении клеточной культуры, синхронизированной на отдельных периодах интерфазы, а также в условиях защиты или сенсибилизации. Из табл. III.1 видно, что при дозах облучения, различающихся даже в 9 раз, но вызывающих одно и то же подавление жизнеспособности клеток, одинаковой оказывается и доля безаберрантных клеток.

Из табл. III.1 также следует, что доля клеток без хромосомных аберраций несколько меньше доли выживших клеток, способных к образованию колоний. Это может быть объяснено тем, что некоторые аберрации обусловливают гибель только одного из потомков облученной клетки, вызывая образование неполноценных абортивных колоний. Близкое соответствие кривых гибели и снижения числа клеток аберраций хромосом наблюдается и при учете аберраций не в метафазе, а в анафазе (см. также рис. III.11).

 

Таблица III.1. Корреляция между аберрациями хромосом и выживаемостью клеток китайского хомячка при разных условиях облучения

Вариант опыта, стадия

клеточного цикла

в момент облучения

Поглощен­ная

доза

облучения. Гр

Выживаемость клеток.­ %

Нормальные

метафазы

без аберра­ций. %

g1

2,1

30,2

26.6

g2, 48-часовая сенсибилизация

бромдезоксиуридином

0.7

 

32,4

 

24,0

 

g1, защита клеток цистеамином

4,7

29,8

26,0

S, поздняя

3,1

30,3

20,5

S, поздняя зашита цистеамином

6,4

31,3

24.0

 

 

 

Рис. III.11. Выживаемость (A) и доля клеток без аберраций хромосом (Б) при облучении культуры клеток китайского хомячка:

1 — γ-нзлучение 137Cs, 2 протоны 200 МэВ

 

На рис. III.11 в отличие от данных, представленных в табл. III.1, число клеток без аберраций здесь несколько больше числа выживших клеток. Это определяется тем, что анафазный метод выявляет не все аберрации (по некоторым данным, в два раза меньше, чем метафазный), например, потому, что фрагменты увлекаются расходящимися хромосомами в анафазные «шапки», где их нель­зя обнаружить. Но и в этом случае существует соответствие характера кривых, а одинаковое снижение эффекта облучения при переходе от γ-излучения к протонам высоких энергий, выявляемое по обоим крите­риям, также свидетельствует о связи аберраций хромосом с клеточной гибелью. Отсутствие полного соответствия между выживаемостью кле­ток и возникновением аберраций (во многих работах отмечено 20 — 30%-ное расхождение между уровнем погибших и аберрантных клеток) не умаляет роли аберраций хромосом в качестве пригодного ко­личественного критерия клеточной радиочувствительности.

При анализе причин летального радиационного поражения клетки следует, прежде всего, рассмотреть вопрос об относительной радиочувствительности двух основных ее компонентов — ядра и цитоплазмы.

Можно утверждать, что результаты абсолютного большинства многочисленных исследований дали весьма убедительные доказательства о несравненно большей радиочувствительности ядра и решающей роли его поражения в исходе облучения клети. Поскольку и сейчас приходится встречаться с противниками этой точки зрения, ниже будут приведены наиболее убедительные примеры доказательства ее справедливости. Рассмотренная выше корреляция между долей клеток с хромосомными аберрациями и летальным эффектом свидетельствует в пользу определяющей роли ядерного материала в исходе лучевого поражения клетки. Однако этот факт сам по себе еще нельзя однозначно интерпретировать как следствие большей радиочувствительности ядра, ибо можно предположить, что повреждения хромосом могут происходить и в результате опосредованных цитоплазматических влияний.   

 

Рис. III.12. Схема опытов Б. Л. Астаурова (объяснение см. в тексте)

 

Прямые доказательства большей радиочувствительности ядра по сравнению с цитоплазмой были получены позже и другими исследова­телями в опытах с прицельным облучением ядра на объектах, в клетках которых оно строго фиксировано. Оказалось, нап­ример, что попадание уже од­ной α-частицы в ядро опло­дотворенного яйца насекомого (наездника) вызывает гибель зародыша, которая в случае облучения цитоплазмы яйца регистрируется лишь после прохождения 15 млн. α-частиц.

Особый интерес представ­ляют также эксперименты, в которых с помощью микропучка протонов (90% частиц находилось в поле диаметром 5 мкм) было показано, что структурные повреждения хромосом в клетках наступа­ют уже после непосредствен­ного их облучения 15—20 протонами, в то время как при облучении различных участков цитоплазмы сотнями тысяч частиц его влияния не обнаружено.

Приведенные примеры наглядно демонстрируют значительно большую радиочувствительность ядра по сравнению с цитоплазмой, однако они не отвергают роль последней в радиационном поражении ядерного аппарата. Более того, существует достаточно много экспериментальных данных о зависимости проявления и размера ядерных нарушений от степени облучения цитоплазмы, что является следствием сложных и пока малоизученных ядерно-цитоплазматических отношений. Важно, что для разных объектов удельный вес прямого поражения ядра и опосредованных влияний может сильно различаться, отражая особенности жизнедеятельности целых клеток и функционирования их основных органелл.

Итак, подводя итог современному состоянию этого вопроса, следует подтвердить правильность точки зрения о решающей роли поражения ядра как первопричины лучевой гибели клетки и его несравненно большей по сравнению с цитоплазмой радиочувствительности. Однако в реализации летального клеточного эффекта несомненна и роль цитоплазмы, которая выражена неодинаково у разных объектов и зависит от их функционального состояния и внешних условий.

Какие же внутриядерные структуры ответственны за жизнеспособность клетки? Естественно, что при этом важны события и поражения, возникающие и определяемые при дозах до 10 Гр, существенных для гибели млекопитающих, ибо в принципе не существует структур, не поражаемых при облучении: все зависит от использованной дозы.

В клетке содержится несколько десятков молекул ДНК, имеющих очень большую длину. (У млекопитающих на клетку приходится 3·109 — 6·109 пар нуклеотидов, общая длина молекул ДНК при этом составляет от 1 до 2 м.). ДНК постоянно связана с белками, которые участвуют в поддержании структуры интерфазного хроматина, формировании хромосом и переносе генетической информации.

Облучение вызывает различные повреждения ДНК и ее комплексов. К их числу относят разрывы молекулы ДНК, образование щелочно-лабильных связей, потерю оснований и изменения их состава, изменения нуклеотидных последовательностей, сшивки ДНК—ДНК и ДНК—белок, нарушения комплексов ДНК с другими молекулами.

Различают одиночные разрывы, когда связь между отдельными атом­ными группировками нарушается в одной из нитей двунитчатой молекулы ДНК, и двойные, когда разрыв происходит сразу в близких участках двух цепей, что приводит к распаду молекулы. При любом разрыве нарушаются считывание информации с молекулы ДНК и простран­ственная структура хроматина.

Одиночные разрывы не приводят к поломкам молекулы ДНК, так как разорванная нить прочно удерживается на месте водородными, гидрофобными и другими видами взаимодействий с противоположной нитью ДНК и, кроме того, структура довольно хорошо восстанавлива­ется мощной системой репарации. Многие авторы поэтому склонны ду­мать, что одиночные разрывы сами по себе (если они не переходят в двойные) не являются причиной гибели клеток.

При дозах до 20 Гр двойные разрывы являются следствием одновременного повреждения обеих нитей ДНК. С увеличением дозы облу­чения, более того, возрастает вероятность перехода одиночных разры­вов в двойные, так как увеличивается возможность того, что независи­мые разрывы в противоположных цепях возникают друг против друга, При действии излучений с небольшой плотностью ионизации (γ- и рентгеновское излучение, быстрые электроны) 20—100 одиночных разрывов вызывают один двойной.

Плотно ионизирующие излучения вызывают значительно большее число двойных разрывов. Такие виды лучевого поражения макромоле­кул удается регистрировать непосредственно после облучения в виде аберраций хромосом.

Расчеты показывают, что уже при дозе 1 Гр в каждой клетке че­ловека повреждается 5000 оснований молекул ДНК, возникает 1000 одиночных и 10 - 100 двойных разрывов, каждый из которых может стать причиной возникновения аберрации.

Исходя из этих представлений, выживаемость клеток во многих случаях может быть описана с помощью, так называемой линейно-квад­ратичной модели Чедвика и Линхаутса. Разрабатывая модель, авторы исходили из того, что при облучении клеток летальными являются двойные разрывы ДНК, которые появляются либо в результате одно­сменного разрыва обеих спиралей ДНК одной ионизирующей частицей, либо в результате совпадений двух независимо образовавшихся одиночных разрывов комплементарных спиралей, оказавшихся напротив друг друга.

Согласно этой модели выживаемость клеток S выражается формулой , где D - поглощенная доза, а α и β — параметры, характеризующие вероятность индукции и репарации разрывов ДНК в облученных клетках. (Данная модель позволяет во многих случаях более точно аппроксимировать экспериментальные данные о выживаемости клеток, чем при использовании формулы с параметрами D0 и n. Однако наглядность последних и удобство их оценки определяет более широкое использование параметров D0 и n, чем α и β. )

Кроме образования разрывов в облученной ДНК нарушается структура оснований, прежде всего тимина, что увеличивает число генных мутаций. Отмечается образование сшивок между ДНК и белком нуклеопротеинового комплекса.

Разработанные к настоящему времени методы позволяют в ряде случаев обнаружить радиационные нарушения в структуре интерфазного хроматина уже при облучении клетки дозой в несколько грей. Так, вязкость интерфазного хроматина в клетках тимуса уменьшается после облучения в дозе 1—2 Гр, а при дозе 1 Гр отмечается подавление синтеза РНК, вызванное нарушениями дезоксирибонуклеопротеинового комплекса.

В последние годы интенсивно исследуется ДНК-мембранный комплекс — сложное структурное образование в области соединения нитей ДНК с ядерной мембраной, в состав которого помимо ДНК входят белок и липиды (рис. III.13). Как показывают данные М. Элкинда и соавторов (1972), распад комплекса и деградацию молекул ДНК можно зафиксировать после облучения клеток китайского хомячка при дозе всего 2 Гр .

Помимо структурных нарушений ДНК в облученной клетке наблюдается нарушение регуляции, прежде всего выдачи в цитоплазму информации от ДНК, а также нарушение функционирования многочисленных внутриклеточных мембран. В этом проявляется роль внеядерных органелл, а также сложных взаимоопределяющих влияний ядра и цитоплазмы.

Многие сложные процессы клеточного метаболизма протекают именно на мембранах, так как последние позволяют обеспечить нужное пространственное разделение реагирующих молекул. Не удивительно, что радиочувствительными оказываются именно те биохимические процессы, для которых необходима пространственная организация участвующих групп ферментов. Снижение энергетического обмена клетки, вызванное поражением митохондрий, в отдельных случаях удается наблюдать после облучения в дозах, равных нескольким Греям. Кроме того, нарушение целостности мембран может приводить к сдвигу ионного баланса клетки из-за выравнивания концентраций калия и натрия (в норме клетка накачивает внутрь калий и высвобождает в окружающую среду натрий), что также неблагоприятно отражается на ходе метаболических процессов.

 

 

Рис. III.13. Основные виды структурных радиационных повреждений:

1 - однонитчатые (одиночные) разрывы в молекуле ДНК, 2 - двунитчатые (двойные) разрывы ДНК, 3 - нарушение связи ДНК с белком, 4 - повреждение структуры ДНК мембранного комплекса, 5 - разру­шение ядерной мембраны, 6 - повреждение мнтохондриальной мембра­ны

 

Наконец, важным последствием облучения является изменение эпигеномной (не связанной с ядерным материалом) наследственности клетки, носителем которой служат различные цитоплазматические органеллы. При этом снижается функциональная активность потом­ков облученных клеток, в чем может состоять одна из причин отдален­ных последствий облучения. Однако главной причиной ре­продуктивной формы гибели клеток при облучении является поврежде­ние ее генетического аппарата.

 

Охарактеризуйте основные параметры кривой выживания.

В чем отличие кривых выживания при действии редко- и плотноионизирующих излучений?

В чем принципиальное различие дозовой зависимости летальных реакций клеток от аналогичной зависимости для обратимых клеточных реакций, например задержки деления?

В чем смысл классических экспериментов Б. Л. Астаурова, доказываю­щих определяющую роль ядра в радиочувствительности клетки?

Охарактеризуйте типы радиационных повреждений ДНК. Какие из них являются причиной аберраций хромосом?

 

Многие радиационные повреждения репарируются. Здесь это явление будет рассмотрено на клеточном уровне.

Феномен пострадиационного восстановления обусловлен тем, что при облучении в клетках, среди прочих, возникают и такие повреждения, которые обычно приводят клетку к гибели, но при определенных условиях могут быть устранены системами ферментативной репарации. Такие повреждения принято называть потенциальными. Их дальнейшая судьба после возникновения двоякая: либо они репарируются, и тогда клетка выживает, либо реализуются, и тогда она гибнет.

Термин потенциальное повреждение — чисто формальное, феноменологическое понятие, так как не определяет какое-либо конкретное молекулярное повреждение, а потому может применяться к любому виду радиационных поражений. В отношении репродуктивной гибели клеток наиболее изучены два вида потенциальных повреждений - сублетальные и потенциально летальные, различающиеся по способу их выявления.

Сублетальные повреждения выявляют методом фракционированного облучения, а потенциально летальные — по изменению выживаемости клеток под влиянием изменения условий, в которых они находятся в первые часы после облучения. Например, не исключено, что часть двойных  разрывов ДНК, образовавшихся при облучении клеток в предсинтетический период, может быть восстановлена за время, оставшееся до репликации ДНК, а те из них, что клетка не успела «залечить» до момента синтеза ДНК, становятся летальными и вызывают ее гибель, образуя аберрации хромосом. Очевидно, что эффективность репарации, т. е. долю выживших клеток, можно увеличить, если искусственно удлинить период G1.

Влияние условий пострадиационного культивирования на последующую судьбу клеток показано многими авторами на различных объектах и в разные годы. Ф. Шерман и Г. Чейз еще в 1949 г. обнаружили увеличение выживаемости облученных дрожжей в том случае, если помещать их на питательную среду не сразу после облучения, а выдержав некоторое время в буферном растворе.

Только в 1959 г. В. И. Корогодину в четко поставленном эксперименте удалось воспроизвести тот же феномен, а главное, правильно объяснить его, доказав реальность существования истинного пострадиационного восстановления, что было зарегистрировано в качестве открытия.

Соответствующие опыты столь изящны по своей простоте и убедительности, что могут служить примером экспериментального мастерства.

После γ-облучения дрожжей штамма Мегри-139-В в дозе 1.2 кГр суспензию клеток разводили 1:10 000 и делили на две части. Из одной производили посев на питательную среду в чашки Петри сразу после облучения и оценивали выживаемость, подсчитывая колонии через 96 ч инкубации при температуре 30˚ С. Другую половину суспензии выдерживали после облучения в течение 48 ч в голодной среде при той же температуре, а затем рассеивали по чашкам. Оказалось, что в первом случае выживало лишь около 0,2 % облученных клеток, во втором - выживаемость наблюдалась почти у 40 %, причем во всех изученных пробах.

Результаты этих опытов, схема которых приведена на рис. III.14, можно рассматривать как прямое доказательство реальности пострадиационного восстановления дрожжевых клеток, способность к которому «внутренне присуща» облученным клеткам, и не зависит от наличия в популяции нелетально пораженных особей.

 

 

Рис. III.14. Схема опыта В. И. Корогоднна, доказывающая реальность существования пострадиационного восстановления дрожжевых клеток

 

Влияние условий пострадиационного культивирования клеток млекопитающих на их последующую  судьбу  продемонстрировано С. Н. Александровым (1959) на клетках рака молочной железы, выращиваемых в разных температурных условиях, а позднее И. М. Пархоменко (1963), которая помещала облученные клетки в фосфатный буфер или ингибировала синтез белка.

Во всех этих примерах речь идет о длительно (в течение нескольких часов) протекающих процессах — медленное восстановление. Hapяду с ними в клетке возникает и другой тип потенциально летальных повреждений, которые реализуются в летальные в течение нескольких минут после облучения. Как показали опыты У. Деви (1972), реализация такого типа поражений в клетках китайского хомячка происходит в условиях нормального метаболизма; снижение температуры среды до 20°С во время или сразу после облучения затормаживает процессы реализации, но не влияет на одновременно идущие восстановительные реакции, в результате чего поражение клеток уменьшается.

В 1981 г. А. В. Глазуновым и Ю. Г. Капульцевичем у дрожжей обнаружено и быстрое восстановление. Оказалось, что выживаемость диплоидных дрожжей при высеве их после облучения на питательную среду, содержащую 8 или 10%  NaCl, зависит от температуры во время облучения: понижение температуры с 20 до 3 - 0°С приводит к существенному снижению выживаемости. Выдерживание клеток, облученных при 0°С, в воде при 28°С уже через 30—40 мин приводит к быстрому повышению выживаемости.

Эффект быстрого восстановления  жизнеспособности нельзя обнаружить, облучая клетки при комнатной температуре или высевая их на стандартную питательную среду, так как в этих условиях восстановление успевает завершиться. Этот тип пострадиационного восстановления у дрожжей вносит большой вклад в регистрируемую выживаемость этих клеток в стандартных условиях (при высеве облученных клеток на стандартную питательную среду) в отличие от медленного пострадиационного восстановления.

 

 

Рис. III.15. Быстрое (1) и медленное (2) вос­становление жизнеспособности диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae после γ-облучения в дозе 40 Гр

 

Для примера на рис. III.15 показана выживаемость дрожжей на солевой (10 % NaCl) (кривая 1) и стандартной (кривая 2) питательных средах в зависимости от времени выдерживания клеток в воде при 28˚ C. В первые 30—40 мин происходит быстрое увеличе­ние выживаемости клеток на солевой среде до постоянного значения, которое сохраняется в течение последующих одного - двух часов, что соответствует завершению быстрого пострадиационного восстановле­ния; дальнейший рост выживаемости обусловлен медленным восста­новлением, заканчивающимся через 40 - 50 ч. При высеве облученных клеток на стандартную питательную среду (без NaCI) можно наблю­дать лишь медленное восстановление жизнеспособности.

Быстрое восстановление наблюдали как после γ-облучения, так и после облучения α-частицами 238Pu. Рассматриваемый тип восстанов­ления, как и медленное, отсутствует у гаплоидных дрожжей, с чем ав­торы связывают повышенную радиочувствительность гаплоидных дрож­жей по сравнению с диплоидными.

Придавая большое научное и принципиальное значение рассмотрен­ному феномену репарации потенциально летальных повреждений дрож­жевых клеток, где он так сильно выражен, следует иметь в виду, что вклад такого типа репарации в повышение выживаемости клеток млеко­питающих оказывается несоизмеримо меньшим. В экспериментах in vitro показано, что выживаемость многих видов клеток млекопитаю­щих за счет восстановления от потенциально летальных повреждений может быть повышена не более чем в 2—3 раза (в зависимости от дозы).

В настоящее время еще не разработаны методы количественной оцен­ки репарации потенциально летальных повреждений непосредственно in vivo, однако в косвенных экспериментах получены убедительные дан­ные о реальности этого процесса и в организме. На многих перевивных опухолях экспериментальных животных показано, что выживае­мость опухолевых клеток, оцениваемая in vitro, зависит от времени их рассева после облучения самих опухолей in vivo. Так, например, вы­живаемость клеток асцитной или солидной опухоли Эрлиха при посеве клеток не сразу, а через 2 ч после облучения в дозе 10 Гр возрастает вдвое, а при посеве клеток некоторых фибросарком через 6 ч после об­лучения последних она увеличивается в 2—5 раз. Наблюдаемое в этих экспериментах возрастание выживаемости происходит благодаря репа­рации части потенциально летальных повреждений, что свидетельству­ет о существовании аналогичного процесса и в организме, количествен­ное выражение которого, по-видимому, может различаться у разных тканей.

Восстановление клеток китайского хомячка от сублетальных повреждений полностью проходит за 2 – 3 ч. У других клеток этот интервал может быть несколько большим; например, у клеток костного мозга мышей он равен 5 – 6 ч.

 

Характер кривых выживаемости клеток при фракционированном воздействии.

 

 

Рис. III.16. Восстановление плеча на кривой выживания клеток лимфомы мышей при повторном облучении (по Дж. Толмачу, 1970}:

1 - однократное облучение, 2 - повтор­ное облучение через 4 ч после первого

 

На рис. III.16 представлены результаты соответствующих экспериментов, свидетельствующие, что при повторном облучении клеток, сохра­нивших жизнеспособность после первого облучения, форма кривой их выживаемости (2) повторяет соответствующую кривую при однократном облучении (1). На ней вновь возникает плечо (величина которого при полном восстановлении не отличается от регистрируемого при пер­вом облучении), а наклон (т. е. D0) не изменяется. Аналогичным обра­зом величины указанных параметров не изменяются и при многократ­ном облучении, что проверено на разнообразных клетках в культуре ткани.

Иными словами, радиочувствительность выживающих после облучения клеток не отличается от контрольных, так как степень их восстановления (по данному критерию) не уменьшается при повторных экспозициях.

Эффективность восстановления (ЭВ) от сублетальных повреждений оценивают по величине так называемого фактора восстановления — отношения выживаемости клеток при фракционированном облучении к выживаемости при однократном облучении, или по величине разности доз двукратного (D2) и однократного (D1) облучения, требуемых для достижения одинакового эффекта (ЭВ = D2D1). В случае дробления дозы на N фракций формула имеет вид: ЭВ = (D2D1)(N 1). Вели­чина фактора восстановления зависит от собственной интенсивности восстановления и от скорости перехода клеток в более чувствительные фазы цикла, причем эти процессы противоположно влияют на радиочувствительность клеток в момент 2-го облучения.

Фактор репарации сильно зависит также от дозы облучения, при­чем как от первого, так и от последующих. Если доза недостаточно ве­лика и не выходит за пределы Dq, репаративные возможности клетки не могут полностью выявиться и фактор репарации невелик.

Способность к восстановлению при фракционированном облуче­нии хорошо коррелирует с ве­личиной плеча, поэтому такие параметры кривой выжива­ния, как п и особенно Dq, поз­воляют предсказать степень поражения различных тканей при повторных облучениях, что и используют на прак­тике. Отсутствие плеча на кривой выживания, как это имеет место, напри­мер, при воздействии плотноионизирующими излуче­ниями или при использова­нии некоторых модифициру­ющих агентов, свидетель­ствует об ингибировании про­цессов репарации или образовании нерепарируемых по­вреждений.

Наиболее изучена репарация структурных повреждений ДНК, которым приписывают большую роль в клеточной гибели. Такие повреждения ДНК, как одно- и двунитевые разрывы, могут быть количественно определены в разное время после облучения специальными методами, например, с помощью седиментации ДНК в градиенте плотности сахарозы после мягкого лизиса клетки.

Основные типы репарации.

По времени осуществления различают дорепликативную, пострепликативную и репликативную репарации.               

Дорепликативная репарация (до этапа удвоения ДНК) может происходить путем воссоединения разрывов, а также с помощью удаления (эксцизии) поврежденных оснований. В воссоединении одиночных разрывов участвует несколько ферментов. В простейшем случае разрывы могут быть воссоединены лигазой. В других ситуациях требуется полная ферментативная система репарации, включающая специфические эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимеразу, ДНК-лигазу, а также вспомогательные ферменты, обеспечивающие подготовку концов ДНК для заключительного акта репарации — лигазного воссоединения.

Исследованиями, проведенными на бактериальной ДНК, выявлены три типа репарации одиночных разрывов — сверхбыстрая, быстрая и медленная. Сверхбыстрая завершается в течение 1—2 мин и обеспечивается одной ДНК-лигазой. Быстрая репарация, осуществляемая с помощью ДНК-полимеразы 1, воссоединяет 90% разрывов, остающихся после сверхбыстрой репарации. Время воссоединения половины разрывов составляет в зависимости от температуры от 1 до 10 мин. Медленная репарация завершается за 40—60 мин, воссоединяя около двух разрывов на каждую цепь ДНК, оставшихся после сверхбыстрой и быстрой репараций.

Феномен репарации двухнитевых разрывов в ДНК впервые был обнаружен у Micrococcus radiodurens, а в последние годы показан и на клетках млекопитающих. В клетках HeLa полное восстановление молекулярной массы ДНК наступает в течение 2,5 ч пострадиационной инкубации. Механизм этого вида репарации неясен, а сам эффект восстановления двойных разрывов долго вообще не удавалось наблюдать, хотя в последние годы он был показан в ряде лабораторий.         

Наряду с разрывами ДНК после облучения возникают множественные повреждения оснований, последние ликвидируются системой эксцизионной репарации, проходящей с помощью репаративного синтеза, который представляет собой многоэтапный процесс типа выщепление - замещение. В начале повреждение узнается специфической γ-эндонуклеазой, после чего происходит выщепление (инцизия) поврежден­ного участка вблизи измененного основания, затем - экзонуклеотическая деградация поврежденной цепи с захватом смежных неповреж­денных нуклеотидов и, наконец, -  репаративный синтез в области образовавшегося дефекта при участии ДНК-полимеразы 1 и полинуклеотидлигазы комплементарного участка неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы (шаблона).

Пострепликативная репарация постулируется на основании то­го факта, что некоторые клетки млекопитающих выживают при большой дозе облучения, несмотря на пониженную способность к удалению пиримидиновых димеров. Механизм этого вида ре­парации точно не изучен, предполагают разные варианты синте­за ДНК на поврежденной матрице.

Репликативная репарация — восстановление ДНК в процессе ее репликации. Этот тип репарации осуществляется удалением в хо­де репликации повреждений в зоне точки роста цепи либо про­должающейся элонгацией в обход повреждений.

К настоящему времени, несмотря на значительный прогресс в изуче­нии проблемы репарации, нерешенными остаются многие вопросы, ка­сающиеся молекулярных механизмов этого процесса и его роли в пострадиационной выживаемости клеток. Результаты соответствующих экспериментов показывают, например, что связь восстановления жиз­неспособности клетки с репарацией одиночных разрывов ДНК не безусловна. С одной стороны, последняя заканчивается в течение получаса, т. е. быстрее, чем восстанавливается сама клетка, а с другой — полная репарация разрывов наблюдается и при очень больших дозах, составляющих десятки грей, когда выживают лишь одиночные клетки. Еще нет строгих данных о том, что «отремонтированная» ДНК обладает абсолютно теми же свойствами, что и исходная. (В равной степени это относится и к восстановлению клеток, регистрируемому по их выживаемости, ибо при этом неизвестна функциональная активность таких выживших клеток, а тем более судьба их потомков в отдаленные сроки.)

Как уже было показано, репарация повреждений ДНК - процесс метаболический; она осуществляется ферментами, постоянно присутствующими в клетке, участвующими, как в ее нормальном метаболизме, так и в реакциях восстановления от различных (не только радиационных) повреждений. Эти мощные репарационные системы, по всей видимости, ликвидируют и большую долю радиационных повреждений ДНК.

Поскольку пострадиационная репарация — процесс ферментативный, ее интенсивность, а, следовательно, и судьба облученной клетки зависят от общего уровня клеточного метаболизма.

Для работы ферментов репарации требуется энергия. Если образование АТФ подавить, например, фторидом натрия, то скорость восстановления снижается. При небольшом уменьшении общей скорости метаболизма, например, понижением температуры до комнатной, эффективность восстановления не меняется. При снижении температуры до 20°С наблюдается временная задержка в восстановлении некоторых клеток. Интенсивность восстановления значительно снижается при 8˚С, а при 2 - 5°С — приостанавливается.

Ферментативная природа репарации определила и применение для ее изучения ингибиторов различных синтетических процессов. Однако при анализе их действия на молекулярном и клеточном уровнях получены весьма противоречивые результаты, что в основном определяется множеством метаболических процессов, обусловливающих репарацию особенно в клетках высших организмов.

Несмотря на многообразие репарационных процессов, весьма вероятно, что природа сублетальных и летальных повреждений одинакова. Согласно точке зрения М. Элкинда репарация в клетке начинается сразу после облучения, причем если повреждения не слишком тяжелы, то некоторые из них клетка может отрепарировать и, таким образом, сохранить жизнеспособность в смысле неограниченного размножения. Тяжелые же, множественные повреждения полностью отрепарировать клетке не удается. Если 2-е облучение отстоит во времени от 1-го, то таких тяжелых повреждений возникает меньше, ибо повреждения от 2-го облучения образуются в клетках, частично уже восстановившихся после 1-го облучения. В результате общее число повреждений оказывается меньшим, чем при эквивалентной дозе однократного об­лучения, и соответственно большим будет число выживших клеток. Следовательно, клетка, которая выживет после однократного облуче­ния за счет репарации от потенциально летальных повреждений, вновь приобретает способность накапливать сублетальные повреждения, т.е. ее радиочувствительность становится такой же, как и у необлучен­ной клетки.

Несмотря на привлекательность такого унитарного подхода и неко­торые подтверждающие экспериментальные данные, нет достаточных оснований для его безоговорочного признания. Поэтому принятые термины остаются в силе, хотя может оказаться, что «отличия» субле­тальных повреждений от потенциально летальных можно свести к раз­личиям в методах их регистрации.

Выше было показано, что самые разнообразные лучевые реакции клетки (задержка митоза, индукция хромосомных аберраций, степень угнетения синтеза ДНК и др.) зависят от стадии ее жизненного цикла.

Теперь, завершая главу о клеточной радиочувствительности, сле­дует ясно представлять, что вероятность летального исхода для облу­ченной клетки определяется совокупностью многих факторов и про­цессов, а реализация последних, в свою очередь, зависит от ряда усло­вий, в которых пребывает клетка в момент облучения, особенно от ста­дии клеточного цикла.

Выживаемость клеток при облучении их на разных стадиях цик­ла закономерно меняется, что свидетельствует о различии в радиочувствительности этих стадий. Самыми радиочувствительны­ми клетки оказываются во время митоза. Дальнейшее изменение радиочувствительности несколько различно у разных видов кле­ток, однако, как правило, она минимальна (а выживаемость максимальна) при облучении в конце S-стадии, где радиочувствительность примерно на порядок ниже, чем при митозе (рис. III.17 А).

Такой характер изменения распределения радиочувствительности по циклу не универсален. Детальное изучение последствий облучения клеток китайского хомячка линии V-79, проведенное У. Синклером, обнаружило у них только один максимум радиорезистентности, приходящейся на конец S-периода (рис. III.17 Б). Выживаемость клеток, облученных в этот момент, в 40 раз выше, чем при облучении в митозе. Особняком находятся данные, полученные при изучении различных линий клеток L (фибробластов мыши), у которых период G1 намного радиорезистентнее, чем периоды S и G2.

 

Рис. III.17. Радиочувствительность клеток на разных стадиях цикла. A - клетки HeLa; Б — китайского хомячка линии V-79 (по У. Сннклеру, 1970)

 

 

Рис. III.18. Радиочувствительность отдельных стадий цикла кле­ток китайского хомячка линии V-79 при разных дозах облу­чения (обозначены цифрами у кривых, Гр) (по У. Синклеру, 1970)

 

 

 

Рис. III.19. Кривые выживаемости кле­ток китайского хомячка линии V-79 при облучении на разных стадиях цикла (по У. Синклеру, 1970)

 

Таким образом, в обычной асинхронной популяции клетки могут быть подразделены на ряд субпопуляций с разной радиочувствительностью. Зная чувствительность клеток на разных фазах цикла и долю клеток в каждой из этих фаз, можно рассчитать радиочувствительность всей популяции. Следовательно, радиочувствительность ткани и кле­точной популяции может быть изменена рядом факторов, меняющих распределение клеток по стадиям цикла (такое воздействие называет­ся синхронизацией), даже если чувствительность самих клеток при этом не меняется. Следует иметь в виду еще одно обстоятельство, ко­торое не всегда учитывается даже в специальной литературе. Оказыва­ется, что различия в радиочувствительности отдельных фаз цикла вы­ражены в разной степени при разных дозах облучения.

Причина этого явления состоит в изменении формы кривых выжи­ваемости клеток, облученных на разных стадиях цикла. При переходе от митоза к стадии S способность к репарации возрастает - увеличиваются плечо и экстраполяционное число п и снижается радиочувствительность - уменьшается наклон кривой выживания и соответственно увеличивается D0 (рис. III.19, табл. III.5).

 

Таблица III.5. Параметры кривых выживания клеток китайского хомячка при облучении на разных стадиях цикла (по У. Синклеру, 1970)

 

Стадии цикла

n

D0, Гр

М

1

1,3

G2

>1

1,3

G1

2

1,6

S (ранняя)

2—3

1,9

S (поздняя)

10

2.0

 

Различия в выживаемости сильно увеличиваются с возрастанием дозы облучения, что и приводит к зависимости, изображенной рис. III.18.

В настоящее время отсутствуют адекватные методы оценки основных радиобиологических параметров покоящихся клеток in vivo. Соответствующие данные об этих свойствах получены в основном путем экстраполяции результатов экспериментов с облучением стационарных культур, используемых в качестве модели покоящихся клеток. Согласно этим данным если и существуют различия в радиобиологических свойствах между клетками, покоящимися и находящимися в цикле, то они невелики. Например, есть сведения о том, что клетки в стационарном состоянии не восстанавливаются от сублетальных повреждений. Однако клетки приобретают эту способность в том случае, если после 1-го o6лучения их поместить в оптимальные условия развития — в свежую полноценную среду с небольшой плотностью клеток. Известны данные и об отсутствии различий в лучевых реакциях покоящихся клеток in vivo. Например, установлена одинаковая степень радиочувствительности хромосом покоящихся и делящихся клеток печени. Анализ и оценка этих работ будут проведены в соответствующих главах при рассмотрении вопросов восстановления организма и отдаленных эффектов облучения.

 

Что такое потенциальные радиационные повреждения клетки?

Какими методами выявляют сублетальные и потенцнально-летальные повреждения?

Расскажите об экспериментах М. Элкинда и В. И. Корогодина.

Какова радиочувствительность клеток на разных стадиях цикла?

 

Тому, кто упорно ищет, часто удается что-нибудь обнаружить, хотя и не всегда имен­но то, что он ищет.

А. Моруа

 

Можно ли искусственно моди­фицировать радиочувствительность биологических объектов: сделать их по желанию более устойчивыми к действию излу­чения или, напротив, усилить их поражение? Средства ослабления и усиления лучевых ре­акций; протекторы и сенсиби­лизаторы. Количественные кри­терии модификации радиочувствительности. Кислород - уни­версальный радиомодифицирующий агент. Кислородный эф­фект.

 

§3 Модификация радиочувтвительности. Кислородный эффект

 

В начале 50-х годов появились сообще­ния о реальной возможности ослабле­ния летального эффекта облучения жи­вотных путем предварительного (перед облучением) введения в организм неко­торых химических соединений. Они по­лучили название протекторов (от лат. protector защитник, покровитель), а сам процесс ослабления поражения назвали химической защитой. Рассмотрим принципиальную возможность искусственного повышения радиоустойчивости клетки и организма.

Не менее активно разрабатывается и альтернативная сторона проблемы, возникшая несколько позднее, — поиск средств, усиливающих лучевое поражение. В этом, прежде всего, заинтересована радиационная онкология, так как радиорезистентность многих опухолей не позволяет подвергнуть их облучению в нужной степени из-за опасности необратимого повреждения нормальных тканей. Такие средства, снижающие радиорезистенгность, были найдены. Они получили название сенсибилизаторов. Разработка путей сенсибилизации идет параллельно с получением новых сведений о механизмах лучевого поражения клетки: используют, например средства, усиливающие первичное поражение ДНК, ингибиторы восстановления, агенты, синхронизирующие клетки на наиболее радиочувствительной стадии клеточного цикла или, напротив, избирательно повреждающие клетки на радиорезистентных стадиях,

Говоря о модификации лучевого поражения, обычно используют два ставших традиционными альтернативных понятия — защита и сенсибилизация, имея в виду, что как защитные, так и сенсибилизирующие агенты применяются, а, следовательно, и действуют только перед и во время облучения при обязательном условии, что сами они не влияют на жизнеспособность модифицируемого объекта. Накопленный опыт показал, однако, что, во всяком случае, в интересах прикладной радиобиологии, целесообразно заменить термины радиосенсибилизация и защита на более общие понятия — соответственно усиление и ослабление лучевого поражения, приняв, что и то и другое может быть достигнуто независимо от времени использования (до или после облучения) модифицирующего агента.

 

 

Рис. III.20. Оценка усиления действия радиации (объяснение см. в тексте):

1 — агент, 2 радиация

 

В принципе возможны три результата комбинированного воздействия двух (или нескольких) агентов (рис. III.20):

  1. аддитивность, когда результат совместного действия равен сумме эффектов каждого из агентов, независимо от последовательности их применения;
  2. синергизм, когда результат совместного их применения превосходит эффект, ожидаемый от аддитивного действия;
  3. потенцирование, когда действие одних агентов, как и при синергизме, усиливается другими, которые сами по себе (в отли­чие от синергизма) наблюдаемого эффекта не вызывают. (Эти определения справедливы только в случае линейной зависимости вызываемых эффектов от дозы каждого из агентов (рис. III.20). Несколько более сложным является определение понятия синергизма при нелинейности этих зависи­мостей.)

Таким образом, в классической интерпретации радиосенсибилизация, являясь разновидностью эффекта потенцирования, представляет собой лишь частный случай усиления радиочувствительности.

Все сказанное относится и к проблеме противолучевой защиты. Здесь также, во-первых, уже самой жизнью выделены так называемые средства ранней терапии, эффективные при применении непосредст­венно или в ближайшее время после облучения. К ним относятся, на­пример, препараты ДНК, гемотрансплантаты, полисахаридные комп­лексы и др. Во-вторых, сейчас уже ясно, что нельзя сводить механизм противолучевой защиты протекторами только к ослаблению первич­ных актов поражения. Учитывая многоэтапный процесс развития по­следнего, имеется возможность влиять на каждый из его этапов. Более того, в последнее время становится все более популярной точка зрения о том, что действие всех радиозащитных агентов реализуется только через ранние репаративные процессы, и лишь скоротечность последних не позволяет или, точнее, затрудняет регистрацию эффекта при применении защитных агентов в процессе или после облучения (Л. X. Эйдус, Ю. Н. Корыстов, 1984).

Для оценки радиомодифицирующего эффекта, вне зависимости от избранного показателя поражения, могут быть использованы три критерия.

Абсолютная величина разности между показателями в опыте (облучение с используемым модифицируемым агентом) и в контроле (само по себе облучение в той же дозе);

Индекс эффекта - отношение показателей в опытной и контрольной группах.

Фактор изменения дозы (ФИД) - отношение равно эффективных доз в опыте и контроле; как при усилении, так и при ослаблении лучевого эффекта берется отношение большей дозы к меньшей.

 

 

Рис. III.21. Влияние протекторов на

гибель мышей, облученных в до­зах 7—12 Гр;

1 - контроль, 2 - цистафос, 3 - АЭТ, 4 – мексамин, 5 - АЭТ+мексамин;

ФИД, вычисленный для доз, вызываю­щих 50%-ную гибель мышей, равен 1,5; 1,55; 1,53 и 1,83 соответственно

 

 

 

Рис. III.22. Кривые выживания клеток лейкемии Р-388, облученных в орга­низме мышей через 4 дня после че­тырех ежедневных внутрибрюшинных инъекций 5-йоддезоксиуридина (по Р. Берри, 1965):

1 - без ЙДУР, 2 - 100 (мг/кг)x4, 3 - 300 (мг/кг)x4, 4 - 500 (мг/кг)x4;  ФИД, вычисленный по 10%-ной выживаемости (в порядке возрастания концентрации сен­сибилизатора), составляет 1,3; 1,4 и 2,2

 

Кроме химических модифицирующих агентов с давних пор извест­но о сильном влиянии на исход лучевого поражения кислорода.

В 1909 г. Г. Шварцем было замечено, что на гиперемированной коже облу­ченных больных остается менее пигментированная область, повторяющая форму тубуса рентгеновской трубки. Как потом стало ясно, причиной этого явления было несовершенство аппаратной техники того времени. Вследствие малой мощ­ности трубки облучение производили на минимальном расстоянии от тела и часто пережимали тубусом питающие кожу сосуды, что приводило к временной ло­кальной ишемизации, а, следовательно, к снижению концентрации кислорода, от которой, как выяснилось позднее, в значительной степени зависит радиочувствительность.

Под кислородным эффектом (КЭ) обычно понимают явление уси­ления лучевого поражения при повышении концентрации кис­лорода по сравнению с наблюдаемым в результате облучения в анаэробных условиях.

 

Рис. III.23. Кривые выживания клеток тайского хомячка, подвергнутых ре невскому облучению:

1 — в воздухе, 2 в азоте; дозы. вызывающие одинаковую выживаемость в азоте и воздухе, составляют 30 и 10 Гр соответственно; ККУ=3

 

КЭ - универсальное явление в радиобиологии. Он обнаружен по различным показателям лучевого поражения, как в модельных системах, так и в экспериментах на всех уровнях биологической организации. Тем не менее, еще по сей день, нет полной ясности в том, какие свойства, присущие кислороду, ответственны за его радиомодифицирующее действие.

В макромолекулах при их ионизации возникают скрытые повреждения, которые в отсутствие кислорода сами по себе еще не ведут к потере активности, однако, будучи фиксированы кислородом, переходят в явные повреждения.                             

Время существования таких кислородозависимых потенциальных повреждений в принципе может быть весьма большим. Так, еще в 50-х годах Л.Х. Эйдус показал, что в молекулах белков такие повреждения сохраняются в течение десятков минут и часов. Столь длительное последствие, однако, не обнаруживалось в опытах с нуклеиновыми кислотами. Наличие в живой клетке SH-соединений, немедленно взаимодействующих с потенциальными повреждениями, практически исключает возможность определения истинной продолжительности последних.

Количественным выражением изменения эффекта облучения под влиянием кислорода служит ФИД, который в этом случае называют  коэффициентом  кислородного  усиления - ККУ (OERoxygen enhancement ratio).

Для примера на рис. III.23 приведены данные об изменении эффективности воздействия излучения в 3 раза за счет КЭ.

Участие кислорода в реализации возникающих под влиянием образования потенциальных повреждений в клетках происходит в момент восстановления. Наиболее четко это продемонстрировано (1958) в изящных экспериментах с использованием метода сверхбыстрого смешивания и импульсного облучения. Предварительно было установлено, что добавление кислорода к бактериям, находящимся в условиях аноксии, за 20 мс до облучения обеспечивало полную оксигенацию, и, соответственно, усиливало их поражение. Доставка же кислорода через, 5 – 10 мс после импульсного облучения (длительность импульса 7 мс.) уже не модифицировала эффекта, наблюдавшегося в аноксии. Подтверждение этому получено и после усовершенствования методи­ки эксперимента: оказалось, что усиление эффекта становится несу­щественным даже при добавлении кислорода через 2 мс после облуче­ния.

Аналогичные данные о временных факторах проявления КЭ полу­чены на клетках млекопитающих. В конце 70-х годов было показано, что при подведении кислорода к фибробластам китайского хомячка всего через 0,3 мс после облучения ККУ уменьшается с 2,6 (в случае присутствия кислорода в момент облучения) до 1,5. Если же кислород подводили спустя 5 мс после облучения, то ККУ снижался до 1,1. Для получения максимальной сенсибилизации в этих экспериментах кислород надо было подавать в камеру за 1—2 мс до начала облуче­ния. По-видимому, это время было необходимым для того, чтобы кис­лород мог продиффундировать к «критическим» внутриклеточным структурам.

Согласно данным других исследователей, для достижения полной сенсибилизации клеток млекопитающих кислород должен подводиться еще раньше — не позднее, чем за 40 мс до облучения. Подача кислорода за 3—5 мс увеличивает радиочувствительность клеток не более чем в 1,7 раза.

Таким образом, практически сенсибилизирующее действие кис­лорода при облучении животных клеток может проявиться только тогда, когда он присутствует непосредственно в момент облуче­ния.

Несмотря на универсальность феномена КЭ в живых системах и даже при облучении ДНК учет только содержания кислорода оказывается недостаточным. В этих случаях КЭ, тестируемый, например, по инактивации (т. е. утрате биологической активности) ДНК или фагов в растворе, или по гибели клеток, прояв­ляется только в присутствии SH-соединений. Последние конкурируют с кислородом за потенциальные повреждения, возникающие в ДНК, разделяя их судьбу: при фиксации кислородом они, как упоминалось выше, реализуются в явные повреждения — инактивацию, а при  взаимодействии с SH-группой исчезают, и молекула возвращается в исходное состояние.

 

Напряжение кислорода мм. рт.ст.

 

Рис. III.24. Зависимость радиочувствительности клеток от содержания  кислорода (% от атмосферного)  и его парциального  давления при 37˚ C.

1 - 3 мм рт. ст. или 1—2% О2, 2 – воздух, 3 - 100% О2; остальные объяснения см. в  тексте

 

Весьма важно рассмотреть зависимость КЭ от концентрации кислорода. Так как еще не разработаны надежные методы измерения внутриклеточного содержания кислорода, соответствующий контроль проводят в окружающей среде. Как правило, для этого используют методы электродной полярографии и по значениям pO2 (измеряется электродом, помещаемым в питательную среду при измерениях в клеточных культурах или в ткани в экспериментах in vivo) судят о концентрации кислорода в клетке. Учитывая скорость диффузии кислорода и малые размеры большинства клеток млекопитающих, есть все основания считать получаемую информацию достаточно надежной.         

На рис. III.24 представлена классическая зависимость КЭ от концентрации кислорода, впервые экспериментально установленная Л. Греем с сотрудниками в 50-х годах. Отложенная на ординате величина ККУ характеризует относительную радиочувствительность (за единицу принято ее значение в аноксии). В атмосферном воздухе при температуре 37 °С содержится по объему 20,92 % O2, что соответствует ~159 мм. рт. ст. На рис. III.24 показано, что при этом давлении радиочувствительность уже максимальна, обычно она близка к трем и не увеличивается при повышении концентрации кислорода до 100%. С уменьшением парциального давления кислорода (pO2) вначале вплоть до 30 мм орт. ст., радиочувствительность уменьшается очень медленно, а затем более резко; в диапазоне 3—4 мм рт. ст. ККУ составляет два и далее снижается до единицы.

Связь между концентрацией кислорода во время облучения и  радиочувствительностью, представленная графически на рис. III.24,  аналитически выражается уравнением, предложенным Т. Альпер и П. Говард-Фландерсом:                      

,

где 1/D0[O] и 1/D0[A] - величины, характеризующие радиочувствительность, при изучаемой концентрации кислорода (O) или аноксии (A), m -  максимальная величина ККУ, К - константа, равная концентрации кислорода, при которой радиочувствительность является промежуточной между максимальной и минимальной. (Когда опыты ставят в ограниченном диапазоне доз, что не позволяет точно определить D0, а также в исследованиях in vivo, в которых критерием эффекта является поражение всего организма или определенных тканей, а не выживаемость отдельных клеток, ККУ определяют сравнением равно эффективных доз при каких-то определенных уровнях выживаемости.) В примере, приведенном на рис. III.24, величина К составляет 3 мм рт. ст. или ~ 0,5 % О2, а m = 3.

 

Рис. III.25. Зависимость кислородного эффекта от вида ионизирующих излучений. А — рентгеновское излучение; Б—нейтроны с энергией 15 МэВ; В — α-излучение (по Дж Барендсену и др., 1966. 1967)

 

Как и действие химических модификаторов поражения, КЭ наиболее выражен при действии редко ионизирующих излучений. С повышением ЛПЭ он быстро уменьшается и при облучении, например, α-частицами исчезает (рис. III.25).

Общая связь КЭ с ЛПЭ представлена на рис. III.26. Как показали работы последних лет, величина m для разных видов клеток варьирует в диапазоне 2—4. Различия в величине K также велики. Так, для микроорганизмов К равняется 4—6 мкМ кислорода (0,3—0,45 % кислорода в газовой фазе) или 2,5—3 мм рт. ст., а для зародышей пыльцы традесканции и клеток корешков конских бобов - соответственно около 10 и 4 мкМ. Сильно варьируют эти величины и для клеток млекопитающих. Так, по данным разных авторов, обобщенным Б. Каллен и Д. Лансли, колебания  m и K составляют соответственно 2,5 - 4,0 и 2,0 -  6.0 мм рт. ст. Поэтому не следует переносить количественные зависимости КЭ, полученные in vitro, на все многообразие лучевых реакций животных, тем более что на величине КЭ может сказываться состояние репарирующих систем, а также физиологический статус клеток, особенно в составе организма.

 

 

Рис. III.26. Кислородный эффект как функция ЛПЭ, данные по­лучены на культуре клеток почки человека (по Дж. Барендсену, 1966):

темными кружками обозначены тяжелые моноэнергетические частицы, треугольником - рентгеновское излучение 250 кВ, имеющее среднюю ЛПЭ 1.3 кэВ/мкм

 

 

 

Рис. III.27. Связь m с D0 в азоте для 11 мутантов Е. coli, дефектных по репарации (по Т. Альпер, 1968)

 

На рис. III.27 приведена зависимость КЭ от радиочувствительности в азоте для 11 мутантов Е. coli с дефектами репарации, отражающимися на радиочувствительности. Видно, что m при этом изменяется от 1,5 до 4. Как показали дальнейшие исследования О. Сапоро (1977) на оди­нарных и двойных бактериальных мутантах по репарации, КЭ соста­вил соответственно 2,1—2,4 и 1,3 по сравнению с 3 для бактерий дикого типа.

В вышеизложенных данных действие кислорода, присутствующего во время облучения, рассматривали как радиосенсибилизирующее. Однако уже в 60-х годах выяснили, что присутствие кислорода в среде после облучения, напротив, способствует репарации радиационных повреждений. Причем на историческом примере изучения роли кислорода в восстановлении жизнеспособности облученных клеток можно продемонстрировать важность методических аспектов проведения любых экспериментов.

В ранних работах M. Элкинда была показана способность клеток к восстановлению при замене после облучения воздуха на азот, в котором примесь кислорода составляла всего 16 частей на 1 млн. частей азота. Эти данные привели авторов к построению концепции чисто «физико-химического» механизма восстановления, для которого не требуется участия ни энергии, ни кислорода. В последующем, однако, выяснилось, что эти результаты — артефакт, обусловленный применением посуды из полистирола, в котором много растворенного кислорода, диффундирующего к клеткам после замещения воздуха на инертный газ. При замене пластмассы на стекло и использовании хорошо очищенных газов восстановление полностью подавлялось — при содержании 1 части кислорода на 1 млн. частей азота на дозовой кривой исчезало плечо. Увеличение количества кислорода в смесях до 10 частей приводило к появлению плеча, что свидетельствовало о способности клеток к восстановлению, которая увеличивалась с повышением содержания кислорода.

 

 

 

Рис. III.28. Восстановление сублетальных повреждений за время t между фрак­циями в зависимости от концентрации кислорода в среде (асинхронная популяция   клеток  китайского   хомячка (СНО), облучение в дозе, вызывающей 4%-ную выживаемость) (по К. И. Ко­ху, 1979):

1 - воздух, 2 - 200 млн-1O2, 3 - 25 млн-1O2, 4 - 25 млн-1O2

 

На рис. III.28 представлена кинетика восстановления сублеталей при разных концентрациях кислорода в промежутках между фракциями облучения. В аноксических условиях при [O2] < 25 млн-1 восстановления не происходит. С ростом концентрации кислорода скорость восстановления увеличивается и при содержании кислорода в газовой фазе 1000 млн-1 она почти достигает максимума.

Таким образом, кислород выступает при лучевом поражении биообъектов в роли двуликого Януса — с одной стороны, усиливает первичное поражение, а с другой — облегчает пострадиационное восстановление. Относительное значение того и другого аспекта модифицирующего действия кислорода может меняться в зависимости от конкретных условий эксперимента и должно с максимальным вниманием учитываться для правильного истолкования результатов.

Различия в величине КЭ, связанные с функциональным состоянием, в частности с интенсивностью дыхания и видом энергообмена, показаны в  последнее время на разных клетках млекопитающих.

 

Что понимают под аддитивностью, синергнзмом и потенцированием эффектов?

Что такое ФИД и каковы методы его определения?

Что понимают под кислородным эффектом и каковы методы его оценки?

Какова зависимость кислородного эффекта от концентрации кислорода?

Какова связь кислородного эффекта с ЛПЭ?

Как влияет кислород на процессы пострадиационного восстановления?

 

Знание некоторых принципов легко возмещает незнание некоторых фактов.

К. Гельвеций.

 

Связь ОБЭ с ЛПЭ. Методы оценки ОБЭ. Эффект «перепоражения». ОБЭ и кислородный эффект. Другие факторы, влия­ющие на величину ОБЭ. Огра­ничения в концепции ОБЭ.

 

§4 Относительная биологическая эффективность ионизирующего излучения

 

При описании физических основ биологического действия радиации упоминалось о том, что воздействие разными видами излучений, но в равных поглощённых дозах приводит к различным по величине эффектам. Это свойство излучения, часто называемое его качеством, определяется не столько физической  природой излучения, сколько его ЛПЭ. Для количественной оценки качества излучения введено понятие относительной биологической эффективности {ОБЭ}.

ОБЭ оценивают сравнением дозы облучения, вызывающей определенный биологический эффекта, с дозой стандартного излучения, обусловливающей тот же эффект. Обычно в качестве стандартного излучения используют рентгеновское излучение с энергией 180—250 кэВ.

Значение (величину, коэффициент) ОБЭ вычисляют из отношения сравниваемых доз по формуле

ОБЭ = DR /Dx,                          

Где DR - доза рентгеновского излучения, Dx - доза изучаемого излучения; эффект сравнивают по общему критерию. В первом приближении можно считать, что при тщательном соблюдении экспериментальных условий сравниваемого эффекта ОБЭ зависит только от ЛПЭ.

Поэтому, например, протоны, дейтроны и α-частицы, ускоренные до высоких энергий (200 МэВ и более), имеют приблизительно такую же ОБЭ, как и рентгеновское излучение с энергией 200 кэВ, так как они характеризуются близкими значениями ЛПЭ. Те же виды излуче­ния, но с меньшими энергиями и соответственно с большей ЛПЭ, об­ладают и большей ОБЭ.

Увеличение ОБЭ с ростом ЛПЭ легко понять из данных рис. III.29, где схематически представлено распределение актов ионизации вдоль треков заряженных частиц различной природы и энергии в микрообъеме (от поражения которого зависит проявление регистрируемой реакции). Видно, что эффективный объем может совсем не поражаться при редко ионизирующих излучениях; с ростом ЛПЭ вероятность поражения увеличивается.

 

 

Рис. III.29. Отрезок траекторий различных заряженных частиц, дающий представление о распределении актов ионизации и возбуждения

Рис. III.30. Кривые выживания культу­ры клеток человека, подвергнутых облучению   (по  Дж. Барендсену

1968):

1-рентгеновское, 2 - нейтронное,3 - γ-нзлучение

 

На рис. III.30 представлены результаты облучения клеточных культур тремя разными видами ионизирующей радиации, резко различающимися по ЛПЭ: рентгеновским излучением 250 кэВ, нейтронами 15 МэВ и α-частицами. Их ЛПЭ увеличивается от 1.3 кэВ/мкм у рентгеновского излучения до 100 кэВ/мкм у α-частиц. По мере роста ЛПЭ увеличивается наклон кривых и уменьшается экстраполяционное число {сокращается плечо на начальном отрезке кривых},  достигая единицы при α-облучении.

Следовательно, с ростом ЛПЭ повышается поражаемость клеток и снижается их способность к восстановлению. Соотношение  ЛПЭ и ОБЭ имеет максимум. Ощутимый рост ОБЭ начинается с ЛПЭ, равной 10 кэВ/мкм,  достигает максимального значения при ЛПЭ - 100 кэВ/мкм, а с последующим увеличением ЛПЭ (рис III.31) круто  падает. Причина этого явления состоит в том, что гибель клетки происходит после поглощения достаточного количества энергии в некотором критическом объеме. Естественно, что с ростом ЛПЭ такая вероятность увеличивается. Но после некоторых величин ЛПЭ наступает насыщение, и каждая последующая частица теряет энергию в уже убитой клетке; следовательно, эффективность излучений с такой достаточно высокой ЛПЭ падает, так как энергия расходуется вхолостую. (Подробное обсуждение рис. III.31 см. в следующем разделе.)

Это явление наглядно представлено на рис. III.32, где показано, что после оптимального значения ЛПЭ, когда наблюдается максимум пораженных единиц на единицу дозы (т.е. разменивается ровно столько энергии, сколько нужно для поражения всех мишеней), наступает эффект избыточного поражения (overkill).

Такова общая картина связи ОБЭ с ЛПЭ. В действительности она, однако, оказывается более сложной. В основном это объясняется тем, что обычно в расчет принимают средние величины ЛПЭ, но расчет ОБЭ по средней величине ЛПЭ - лишь глубокое приближение, при котором теряются детали пространственного распределения ионов. Особенно сильно это сказывается при нейтронном облучении, характеризующимся размытым спектром энергий, а, следовательно, и разбросом значений ЛПЭ.


 

Рис. III.31. Зависимость ОБЭ от ЛПЭ и величины дозы облучения. А - вы­живаемость культуры клеток человека (по Дж. Барендсену, 1968); Б - выживаемость клеток хлореллы (по Л. К. Векшиной, 1975):

1, 2, 3— результаты γ-облучения в разных дозах; объяснение см. в тексте

 

Рис. III.32. Эффект избыточного поражения, когда до­статочно двух попаданий в мишень (по Е. Холлу. 1973):

1 - низкие ЛПЭ, 2 - оптимальные ЛПЭ, 3 - высокие ЛПЭ («перепоражение»)

 

В последние годы усиленно развивается специальная область дозиметрии — микродозиметрия, построенная на знании специального математического аппарата и учитывающая связь микрораспределения ионизаций с различными клеточными эффектами и его отражение на кривых выживания при различных условиях облучения.

Величина ОБЭ зависит не только от вида излучения и его ЛПЭ, но и от исследуемого эффекта, а также от множества других факторов, перечислить которые, по существу, невозможно. Главные из них, которые всегда следует учитывать, — это величина и мощность дозы, до- и пострадиационные условия, режим фракционирования, наличие, дефицит или отсутствие кислорода.

На рис. III.33 представлен пример зависимости ОБЭ от регистрируемой реакции (и одновременно от ЛПЭ). Наибольший летальный эффект наблюдается при ЛПЭ, равной 100-150 кэВ/мкм, тогда как за­держка клеточного деления про­должает усиливаться и при даль­нейшем увеличении ЛПЭ, дости­гая максимума при 200 — 300 кэВ/мкм. Видно, что степень раз­личий абсолютных величин ОБЭ в зависимости от изучаемой реак­ции меняется при сравнении на разных уровнях ЛПЭ.

 

 

Рис. III.33. Зависимость ОБЭ от регистрируемой реакции и от ЛПЭ при облучении культуры  фнбробластов ядрами Не, С, О и Аг с энергией 10 МэВ/нуклон (по Л. Скарсгарду, 1965);

1 — задержка деления, 2 — выживаемость

 

Весьма важна и практически значима зависимость ОБЭ от дозы и ее распределения во времени. Зависимость от дозы видна, например, на рис.III.31; кривые 1, 2 и 3 отражают соответственно 80, 10 и 1 % выживаемости клеток человека (А) и 90, 50 и 1% выживаемости клеток хлореллы (Б). Видно, что абсолютная величина ОБЭ не является постоянной, а зависит от степени поражения, снижаясь с ее увеличением. В данном случае при 80—90 %-ных уровнях выживаемости клеток почки человека или хлореллы ОБЭ составляет около 8, а при 10 — 1%-ной выживаемости — около 3.

На рис. III.34 изображены типичные кривые выживания клеток млекопитающих после рентгеновского и нейтронного облучения. При однократном облучении (рис. III.34, А) кривая, характеризующая действие рентгеновских лучей, имеет в начальном отрезке большое плечо, которое почти отсутствует на кривой, отражающей результат нейтронного облучения, но у последней несколько более крутой наклон конечного участка. В результате ОБЭ оказывается максимальной (3,0) при меньших дозах (в зоне плеча), уменьшаясь с ростом дозы до 1,5.

При фракционированном облучении, например четырехкратном (рис. III.34, Б), ОБЭ также растет по мере увеличения числа фракций. Это происходит потому, что при дроблении дозы рентгеновского облучения каждый раз жизнеспособность клеток частично восстанавливается, что почти не наблюдается при фракционированном облучении быстрыми нейтронами. В процессе увеличения числа фракций такая утрата эффективной дозы рентгеновского облучения нарастает. В результате при фракционированном облучении нейтронами и рентгеновским излучением различия в дозах выражены в значительно большей степени, чем при однократном. Сравнение доз, вызывающих выживание 0,01 клеток (рис. III.34, А, Б), позволяет заметить, что ОБЭ нейтронов при однократном облучении составляет 1,5, а при фракционированном - 2.6. Иными словами, один и тот же эффект может быть достигнут при фракционированном облучении нейтронами в относительно меньших суммарных дозах (по сравнению с суммарной дозой рентгеновского облучения), чем при однократном облучении. Это явление используют при терапии опухолей нейтронами и другими тяжелыми ядерными частицами, характеризующимися большой ЛПЭ.

Зависимость ОБЭ от распределения дозы во времени может быть выявлена не только при фракционированном облучении, но и при изменении мощности дозы. Так, в лаборатории Г. Ивенса в опытах на традесканции было показано, что быстрые нейтроны при пролонгированном облучении в течение нескольких минут в 10 раз эффективнее индуцировали выход хромосомных аберраций, чем γ-излучение. При пролонгированном облучении, продолжавшемся 49 ч, в той же суммарной дозе ОБЭ достигала 80.

Преимуществом использования плотноионизирующих излучений в лучевой терапии является повышение их ОБЭ в условиях дефицита кислорода, характерного для опухолей, а тем более в аноксии, за счет устранения защитного действия гипоксического фактора с повышением ЛПЭ (см. рис. 40). Это было отчетливо продемонстрировано цитогенетическими экспериментами А. Конжера и Г. Ивенса, показавшими на разных объектах, что ОБЭ быстрых нейтронов, оцененная по аберрациям хромосом в клетках асцитной карциномы Эрлиха и по образованию микроядер в клетках конских бобов, составила в аэробных условиях соответственно 2,5 и 10,5. а в анаэробных — 6 и 18.

Рис. III.34. Зависимость ОБЭ быстрых нейтронов от дозы облучения. А — при однократном облучении; Б — при фракциониро­ванном облучении (объяснение см. в тексте) (по Е. Холлу, 1971)

Поскольку ЛПЭ тесно связана с проникающей способностью ионизирующих излучений, корректная оценка ОБЭ может быть вы­полнена лишь с учетом особенностей распределения дозы в облучаемом объекте. Если это обязательное требование не выполняется, то неиз­бежна неправильная интерпретация результатов.

В качестве примера можно привести реальные данные, послужившие в свое время основанием для ошибочного заключения о наличии некоторых качественных специфических особенностей воздействия оп­ределенных видов радиации. Из данных табл. 6 можно сделать непра­вильный вывод об изменении радиочувствительности мышей и крыс в зависимости от вида излучения. Между тем причина такого наблюде­ния состоит в том, что при одностороннем рентгеновском облучении (как это происходило в данном случае) распределение энергии в теле мыши значительно более равномерно, чем у крысы, в костном мозге которой величина поглощенной дозы из-за этого относительно ниже. При γ-облучении большая проникающая способность γ-кватов ниве­лирует неоднородность распределения энергии, которую не учитывали должным образом при дозиметрии.

Наиболее точная оценка ОБЭ и ее зависимость от ЛПЭ могут быть получены лишь в случае, когда в качестве объекта облучения исполь­зуют изолированные клетки или другие мелкие объекты, в которых энергия излучения распределяется равномерно по всему объему.

Результаты многочисленных экспериментов, проведенных на более крупных животных, с очевидностью показали, что вычисление коэф­фициентов ОБЭ в большинстве случаев вообще теряет смысл, так как не может быть обеспечена адекватность условий опытов и, прежде всего равномерность распределения поглощенных доз в тканях для разных видов излучений.                               

 

Таблица 6. ОБЭ для животных разных видов

Животные

ЛД50/30, Гр

 

 

 

рентгенов­ское

излу­чение. 180 кэВ

γ-излучение

60Со. 1,2 МэВ

ОБЭ

γ-нзлучения

 

Мыши

6,0

7,5

0,8

 

Крысы

7,5

6,5

1,14

 

Весьма показательны результаты исследований С. Риксфорда-Вильха, изучавшего последствия локального облучения глаза обезьян протонами с энергиями 14, 40, 137 и 730 мэВ в диапазоне доз 1,25—40 Гр. Протоны с энергией 14 и 40 МэВ поглощаются соответственно в передней камере глаза и в стекловидном теле; протоны больших энергий проникают в головной мозг. Такой характер распределения поглощенной дозы обусловил и соответствующую клиническую картину поражения по ходу пучка: эритему кожи век, иридоциклит, кератит, эпиляцию, катаракту, повреждение вещества мозга.

В подобных случаях отношение доз, вызывающих одинаковое  действие, правильнее называть не ОБЭ, а отношением равных эффектов независимо от механизма их образования.

Комитет по ОБЭ Международной комиссии по радиологическим единицам и измерениям предложил оставить концепцию только в случаях, когда могут быть строго учтены все условия эксперимента, а различия в биологическом действии сравниваемых видов излучения определяются лишь свойствами последних.

Во всех остальных случаях знание величины поглощенной дозы еще недостаточно для точного предсказания ни степени тяжести, ни вероятности возникновения эффектов поражения. Поэтому, например, для целей радиационной защиты введена так называемая эквивалентная доза, которая лучше коррелирует с возможными неблагоприятными последствиями профессионального облучения.

 

Что такое ОБЭ и каковы методы ее оценки?

Как связана ОБЭ с ЛПЭ?

Какие факторы, кроме ЛПЭ, влияют на величину ОБЭ?

В чем состоят ограничения при оценке ОБЭ?

Что понимают под хронической лучевой болезнью?

Изложите классификацию степеней лучевой болезни в зависимости от дозы облучения и ее распределения во времени.

Чем определяется прогноз поражения?

 

Глупцы, довольствуются тем, что видят смысл во всяком слове.

И.В.Гете.

 

Разгадка основного радиобиологического парадокса - критерий правильной теории. Ко­личественные и качественные подходы к проблеме. Класси­ческий формализм — теория мишени и принцип попаданий. Жизнь и лучевое поражение как вероятностные категории. Стохастический принцип. Ра­диотоксины. Структурно-мета­болическая гипотеза. Новые яв­ления и судьба гипотез.

 

§5 Представления о механизме биологического действия ионизирующего излучения

 

Если   проанализировать   основные вехи формирования взглядов на природу радиобиологического эффекта, то, как и для развития других научных дисциплин, здесь легко установить традиционную зависимость возникновения и судьбы гипотез от возможности интерпретации новых экспериментальных фактов.

Смена представлений в радиобиологии происходила и происходит особенно быстро, так как они в значительной степени связаны с бурным прогрессом ядерной физики и молекулярной биологии.

Можно четко наметить два направления в развитии теоретических построений. Одно из них выражает стремление установить общие, в основном феноменологические, но обязательно количественные закономерности, характеризующие начальные звенья лучевого поражения клетки.

Другое - объединяет представления,  стремящиеся   объяснить все многообразие конкретных лучевых реакций биологических объектов; отсюда преимущественно качественный, описательный характер гипотез этого направления. Наиболее ранние и известные представления, относящиеся к первому направлению, принято обозначать термином количественная радиобиология, хотя, конечно, в радиобиологии есть много и других количественных закономерностей.

Указанным теоретическим направлениям присущи преимущества и свои ограничения. В ряде случаев они могли бы хорошо дополнять друг друга. Между тем, к сожалению, в пылу научной полемики авторы отдельных гипотез, отстаивая свою точку зрения, отвергают другие представления, не имея для этого достаточных оснований, в результате даже искушенному читателю нелегко разобраться в состоянии вопроса. В настоящем учебнике кратко рассмотрены основные гипотезы и ограничен круг явлений, на объяснение которых каждая из них может претендовать.

Камень преткновения на пути разгадки основного радиобиологического парадокса состоит в необходимости правильного истолкования несоответствия между ничтожным количеством поглощенной клеткой энергии излучения и вызываемым экстремальным биологическим эффектом. При объяснении этого парадокса в количественной радиобиологии были сформулированы два положения, лежащие в основе так называемой теории мишени.

Первое из них — принцип попаданий  - характеризует особенности действующего агента — дискретность поглощения энергии. Второе — принцип мишени — учитывает особенность облучаемого объекта — клетки — ее высокую гетерогенность в морфологическом и функциональном отношениях, а, следовательно, различие в ответе на одно и то же попадание.

История количественной радиобиологии восходит к началу 20-х годов, когда Ф. Дессауэр сделал весьма важное обобщение, распространив известные к тому времени физические закономерности взаимодействия излучения с веществом на биологические объекты. Он предположил, что большой биологический эффект при ничтожном суммарном поглощении энергии объясняется тем, что она концентрируется в малых объемах, приводя их к микролокальному разогреву; отсюда и ее название — гипотеза точечного тепла.

Учитывая наличие в клетке более важных для жизни и менее существенных структур и микрообъемов, а также случайное распределение «точечного тепла», Ф. Дессауэр пришел к выводу о том, что исход клеточной реакции зависит от вероятности случайных попаданий дискретных порций энергии именно в эти жизненно важные микрообъемы-мишени. Наблюдая за количественными закономерностями радиобиологических реакций, он предположил, что они осуществляются лишь в том  случае, если в клетке произошло определенное число «попаданий» в мишень.

Действительно, если при анализе зависимости эффекта от дозы при­нять в качестве регистрируемой реакции долю пораженных объектов, то легко обнаружить две специфические черты действия ионизирующих излучений.

1.        Большинство клеточных реакций протекает практически при отсутствии порога, с нарастанием эффекта при увеличении дозы, что трудно объяснить изменением индивидуальной чувствительности, так как требует допущения ее невероятно высокой вариа­бельности.

2.        Кривые выживания, как упоминалось ранее, от­ражают не столько степень проявления эффекта у отдельных осо­бей (клеток) с повышением дозы, сколько увеличение количест­ва (доли) пораженных единиц, т. е. возрастание вероятности про­явления регистрируемой реакции.

Иными словами, летальный эффект ионизирующих излучений име­ет вероятностный характер вследствие случайного распределения элементарных актов первичного взаимодействия частиц с чувствитель­ными объемами облученных объектов. В этом и состоит принципиаль­ное значение первоначальных взглядов, хотя само понятие «точечного тепла» потеряло значение.

Принцип попадания и принцип мишени и основанная на них теория мишени получили свое развитие в трудах Д. Кроузера, Н. В. Тимофеева-Рессовского, К. Циммера, Д. Ли и др.

Использование основных положений теории мишени ограничивается строго определенной областью — анализом самых первичных элементарных радиацион­ных событий. Это становится понятным хотя бы из интерпретации самих терми­нов — мишень и попадание. При рассмотрении радиобиологических эффектов на молекулярном и (или) клеточном уровне термин мишень удобно использовать для формального обозначения того микрообъема, в котором должны произойти одна или несколько ионизаций, приводящих к изучаемой реакции. В зависимо­сти от числа попаданий, необходимых для поражения, различают одно-, двух- или многоударные объекты или реакции, причем учитываются попадания в одну или разные мишени, которые функционально связаны. Отсюда ясно, что попытки применения теории мишени для объяснения природы и этапов формирования конечных лучевых реакций клеток и тем более организмов неправомочны. Так как при формулировании самих понятий «попадания» или «мишеней» не имеются в виду какие-то конкретные физико-химические или биохимические процессы, происходящие в микрообъеме.

Достоинством описываемых теоретических представлений о механизме летального действия ионизирующих излучений является простота объяснения основных экспериментальных данных.

В первую очередь это относится к количественному описанию кривых выживания.

Весьма очевидно, что исходя из принципов классической теории мишени, количество попаданий должно быть прямо пропорциональным дозе облучения. Поэтому в определенном диапазоне доз число пораженных мишеней строго пропорционально дозе, или числу попаданий, так как поражается лишь небольшая их часть из общего количества; в связи с этим зависимость эффекта от дозы имеет вид прямой линии (рис. III.35, А). С повышением дозы облучения вероятность попадания в одну и ту же мишень увеличивается, и хотя общее число попаданий остается пропорциональным дозе, их эффективность уменьшается, и количество пораженных мишеней возрастает медленнее, асимптотически приближаясь к 100 % (рис. III.35, Б). Иначе говоря, количество жизнеспособных единиц с увеличением дозы уменьшается в экспоненциальной зависимости от дозы (см. рис. III.11).

Наиболее простой способ проверки экспоненциальности кривой, получаемой в эксперименте, состоит в логарифмировании числа выживающих объектов. Тогда при представлении экспериментальных данных в полулогарифмическом масштабе зависимость будет выражена прямой линией (см. рис III.11, Б).

Интерпретация основных количественных параметров кривых выживания поначалу исходила непосредственно из теории мишени. Чтобы лучше разобраться в этом вопросе, необходимо вернуться к анализу кривых доза — эффект и провести его с позиций теории мишени.

 

Рис. III.35. Зависимость измене­ния эффекта от дозы облучения. А и Б — при малых и больших дозах соответственно (по Д. Ли, 1963)

 

Рассмотрим определение основного параметра радиочувствительности -  величину d0 или d37, которую в теории мишени принято называть инактивирующей, или среднелетальной (не путать с ЛД50) дозой, на примере анализа одноударного поражения. В качестве такового подразумевают гибель облучаемого объекта от эффективного единичного попадания в мишень.

Тогда если N0 — исходное число объектов, а N — число объектов, не пораженных излучением при дозе d, то выход из строя определенной доли объектов dn/n при приращении дозы dd выражается уравнением dN/N = -dD/d0, где d0 - доза, при которой на каждый объект в среднем приходится одно попадание (от­сюда и наименование d0 - среднелетальная доза).

 

Рис. III.36. Дозовые кривые выживания для объектов с различной ударностью ми­шени. А - в обычном масштабе (S-образные, или сигмоидные, кривые; число уда­ров обозначено на кривых); Б—в полулогарифмическом масштабе

 

При интегрировании данного уравнения получаем

,

где е — основание натуральных логарифмов.

В природе чаще встречается другой тип кривых, характерный для большинства клеток растительного и животного происхождения; при­меры таких кривых были уже приведены ранее. В линейных координа­тах они имеют S-образную форму (рис. III.36, А). В этих случаях говорят о многоударном процессе,  имея в виду, что для инактивации объекта необходимо не одно, а два и более попаданий в единственную мишень или поражение двух мишеней и более, каждая из которых должна быть поражена.

При изображении таких кривых в полулогарифмическом масштабе (рис. III.36, Б) они приобретают плечо, переходящее в прямолинейный участок, наклон которого совпадает с наклоном соответствую­щей одноударной кривой. Экстраполированием прямолинейного участка кривой к нулевой дозе на оси ординат отсекаются отрезки, соответствующие «ударности» мишеней (или их числу). Изображение многоударных кривых в полулогарифмическом масштабе позволяет достаточно точно оценить выживаемость при ее малых значениях (больших дозах) и легко определить экстраполяционное число, характеризующее число мишеней (ударов), поражение которых необходимо для инактивации клеток.

Нужно иметь в виду, что возможность строгого применения теории мишени уже в самом начале была ограничена ее основоположниками (Д. Ли, 1946) областью анализа одноударных эффектов. Интерпретация конкретных многоударных кривых с тех же позиций затруднительна. Прежде всего, это связано с многочисленными экспериментальными фактами изменения экстраполяционного числа при применении самых различных модифицирующих агентов или изменении условий жизнедеятельности объектов, что само по себе не должно сказываться на числе мишеней. Кроме того, экстраполяционное число в ряде случаев достигает десятков и сотен единиц, что не позволяет их отождествить с числом мишеней в клетке.

По мере развития экспериментального изучения репарации потенциальных повреждений размер плеча на кривой выживания стали связывать со способностью клеток к пострадиационному восстановлению, а величиной плеча характеризовать их репарационную способность. Однако и в этом случае возникают большие трудности при попытках интерпретации, с позиций классической теории мишени, многих клеточных радиационных эффектов, обусловленных, например, изменением химизма клетки в результате радиолиза ее жидких компонентов или метаболического взаимодействия различных клеточных органелл. Эта теория не касается природы мишеней, ответственных за гибель клетки. Такими мишенями могут быть уникальные макромолекулы, определенные участки мембран и другие структуры, попадание в которые приводит к поражению. Поэтому для определения природы мишени следует привлекать данные, получаемые при использовании специальных методов исследования. Именно эти обстоятельства уже в 40-ых годах сделали очевидным необходимость строгого ограничения применения теории мишени только для анализа поражения одноударных эффектов.

В частности, потребовалось расширить само понятие попадания, так как стало известно, что первичные повреждения элементарных клеточных структур могут вызываться не только непосредственной их ионизацией, но и опосредованной: химически активными продуктами радиолиза окружающей среды. Кроме того, вследствие обнаружения миграции энергии по макромолекулам даже при непосредственных формах взаимодействия, реализация повреждения может происходить далеко от места первоначального «попадания».

Таким образом, классическая теория попаданий, плодотворная при анализе количественных закономерностей радиационного поражения отдельных мишеней, не ставит своей задачей решения вопроса о том, какими процессами связано поражение мишеней с проявлением конечного эффекта.

Все это обусловило появление в конце 60-х годов новой теории, призванной, согласно определению ее авторов О. Хуга и А. Келлерера, изложить теорию попаданий на основе стохастического прин­ципа.

(В 1966 г. была издана монография О. Хуга, А. Келлерера «Стохастическая радиобиология» (переведена на русский язык в 1969 г.), в которой обобщены собственные идеи авторов, а также проведен анализ большого фактического материа­ла с позиций развиваемых ими взглядов.)

В основе теории мишени лежало предположение о том, что характерные зависимости доза—эффект могут быть отражением квантованного характера взаимодействия излучения с веществом и наличия в клетках высокочувствительных объемов — мишеней.

В случае очень массивных повреждений конечный эффект действи­тельно детерминирован уже на начальной стадии, но в подавляющем большинстве других ситуаций все случайные факторы затрагивают более поздние звенья причинно-следственной цепи, ведущей к конечному эффекту. При этом каждому лабильному состоянию объекта соответ­ствует определенная повышенная вероятность наступления регистрируемой реакции, возрастающая с увеличением предварительного по­вреждения. Таким образом, при формировании радиобиологического эффекта всегда существует суперпозиция множества случайных собы­тий, что и учитывает стохастическое рассмотрение.

При таком подходе любой биологический объект, в частности клет­ку, представляют в качестве лабильной динамической системы, кото­рая постоянно находится в стадии перехода из одного состояния в дру­гое. Вследствие крайней сложности системы любой такой переход со­провождается и связан с множеством комплексных и элементарных сопряженных реакций отдельных клеточных органелл и макромолекул. Естественно, что в процессе жизнедеятельности, благодаря влиянию самых разнообразных, не подлежащих учету факторов и малейших сдвигов в исходном состоянии, возникает вероятность «отказов» в элементарных звеньях, а вследствие этого — «крушения» всей систе­мы. Поэтому любое критическое событие, например митоз или гибель клетки, можно предсказать лишь с известной вероятностью.

На биологическую стохастичность при облучении объекта накладывается стохастичность вследствие случайного характера взаимодей­ствия излучения с веществом, что резко увеличивает вероятность «крушений» системы, происходящих со значительно меньшей частотой и в необлученном контроле.

Стохастическая теория рассматривает различные возмущения биологической системы, возникающие в процессе жизнедеятельности или под влиянием облучения, с позиций теории вероятностей, стремясь описать их моделями, максимально соответствующими представлениям динамической биохимии и молекулярной радиобиологии. В этом случае мишенями являются все компоненты живой системы, а регистрируемая реакция обусловлена суперпозицией самых разных событий.

Существенно, что стохастическая гипотеза учитывает как физиологические, так и индуцированные излучением процессы в их динамике, в то время как классическая теория мишени рассматривает эффекты, вызванные облучением, как строго детерминированные первичными актами абсорбции энергии.

Используя аппарат стохастической гипотезы, можно учесть реальное взаимодействие ряда последовательных попаданий, а также влияние фактора времени, репарационных процессов, роль ЛПЭ и т.д. Все это может быть выражено системой дифференциальных уравнений, описывающих переход биологического объекта под влиянием облучения из одного состояния в другое. В принципе можно учесть количественно влияние любого модифицирующего фактора на соответствующие дозовые зависимости.

Более того, этот аппарат может быть использован для анализа не только кинетических процессов на молекулярном уровне, но и морфологических процессов, образования новой клетки, ее дифференцировки и др.

Таким образом, «... дискретное изображение непрерывных физиологичесих процессов не является приближением, которое принимают только ради удобств, а становится необходимым при изучении различного поведения отдельных единиц популяции ... Действие излучения на клетку свободно укладывается в эту общую схему, что также выражается в дискретных событиях. При этом не существенно, происходят ли соответствующие критические события в результате дискретных актов абсорбции энергии или в результате усиленной облучением лабильности, органически свойственной биологической системе... В этой схеме можно учесть даже такие сложные явления, как феномены обратной связи и механизмы регуляции, т. е. жизненные процессы, которые выявляются в результате нарушений, если экспериментальные данные указывают на необходимость и возможность такого учета» (О. Хуг, М. Келлерер, 1969).

Эффект, обусловленный попаданием в одну из уникальных структур клетки, приводящим ее к гибели, формально может быть описан как с классических позиций теории мишени, так и с позиций стохастической теории. Иными словами, выводы теории мишени являются частным случаем стохастического подхода.

Проведенные обсчеты некоторых экспериментальных результатов с помощь аппарата стохастической теории показали, что для инактивации клеток млекопитающих редко ионизирующим излучением в среднем необходимо совместное действие не менее четырех событий абсорбции.

Итак, в соответствии с основными исходными позициями стохастическая концепция предлагает как бы более «биологическую» интерпретацию кривых доза — эффект по сравнению с их объяснением с позиций теории мишени, хотя основное положение последней о том, что эти кривые определяются в основном случайной природой абсорбции энергии, остается незыблемым.

Для обозначения клеточных повреждений, которые нельзя отождествлять с локальными изменениями клеточных структур, прежде всего генетических, стохастическая теория вводит понятие «дисперсного начального повреждения». Природа такого повреждения весьма разнообразна: изменение клеточных мембран и других множественных струк­тур, инактивация какой-либо жизненно важной системы и др.

Репаративные процессы, сказывающиеся на конечном эффекте, учитываются понятием компенсационной способности объекта. При анализе дозовых кривых с учетом функциональной лабильности био­логических объектов стохастическая гипотеза приводит к пониманию того, что экспоненциальная кривая указывает на систему без компенсаторных механизмов, а сигмоидная — соответствует системам, обла­дающим такими механизмами, эффективность которых снижается при возрастании дозы облучения. Экстраполяционное число же следует рассматривать как количественное выражение компенсационной спо­собности облучаемого объекта, а не как «число мишеней».

Таким образом, сама по себе экспоненциальная зависимость эффек­та от дозы далеко не предопределяет решение о наличии первичных одно- или многоударных реакций, а с полным основанием делает ло­гичной другую интерпретацию.

Подводя итоги изложения обеих концепций — классической тео­рии мишени и стохастической теории, необходимо, прежде всего, под­черкнуть их основное общее свойство — строго количественный подход. Более того, стохастическая теория представляет собой логиче­ское дополнение классических представлений, которые не могли объ­яснить многообразие радиобиологических феноменов, да и не претендо­вали на это.

Вполне естественно, что первоначальные гипотезы исходили из упрощенных представлений о механизме первичных радиобиологиче­ских процессов на основе чисто физических, а позднее радиационно-химических закономерностей, установленных при облучении простых систем. Однако именно эти простые, общие и формальные схемы впер­вые перевели радиобиологию с описательных позиций на прочную количественную основу. Круг возможного применения первоначальных представлений был очерчен еще при их формировании, и в этом плане были получены наиболее значительные результаты. Дальнейшее накоп­ление новых фактов потребовало развития более широких подходов.

Нельзя не заметить, что при этом остались незыблемыми оба определяющих фактора классической теории мишеней — дискретность радиационного агента и функциональная негомогенность биологического объекта. Существенно, однако, что если в теории мишеней последняя определяется наличием фиксированных мишеней, поражение которых уже определяет конечный эффект, то в системе новых представлений показана несостоятельность такой точки зрения, взамен которой развита идея определяющей роли стохастической природы физиологических процессов и их радиационных нарушений.

Стохастическая гипотеза учитывает современные данные о микрораспределении энергии, вариабельности радиочувствительности логических объектов, а также роль репарационных процессов. Тем самым она значительно расширяет круг явлений, которые можно интерпретировать с новых позиций. Она более «биологична» по своей природе, так как устанавливает связи с конкретными морфологическими и функциональными разделами цитологии и физиологии. Однако ее математический аппарат достаточно сложен и это затрудняет ее широкое применение.

Анализ количественных закономерностей различных реакций дрожжевых клеток на облучение показал, что ни классические модели, основанные на принципе попадания, ни концепция биологической стохастичности не способны объяснить всю совокупность полученных экспериментальных данных. Дополнив принцип попадания предположением о вероятностном   характере проявления повреждений, Ю. Г, Капульцевич (1978) предложил вероятностную модель радиационного поражения клетки.

Согласно этой модели разные клетки, подвергнутые облучению в одной и той же дозе, поражаются в разной степени в соответствии с принципом попадания, но в отличие от классических представлений и потенциальные, и реализованные повреждения проявляются с вероятностью меньше единицы. Реализованные повреждения (или индуцированные ими изменения) наследуются при делении клеток и с некоторой вероятностью, зависящей от числа этих повреждений, приводят к неосуществлению клеточного деления. При этом вероятность проявления повреждения может зависеть как от биологических (генетических) особенностей клеток, так и от условий их культивирования, увеличиваясь при ухудшении этих условий.

Вегетативное размножение облученных клеток согласно этой модели - случайный процесс «рождения и гибели», приводящий к появлению нежизнеспособных клеток в отдельных размножающихся клонах (т. е. к наблюдающейся в эксперименте частичной инактивации); дело случая, образует ли данная облученная клетка макроколонию или погибнет после того или иного числа делений.

Таким образом, формально вероятностная модель, являясь как бы синтезом принципа попадания и стохастической концепции, используя сохранившие значение основные положения первого, дополняет последнюю, расширяя диапазон явлений, которые могут быть интерпретированы с позиций биологической стохастичности. Описывая не только качественно, но и количественно (с помощью специальной системы уравнений) различные проявления нарушений репродуктивной способности клеток, вероятностная модель выгодно отличается от классических схем тем, что позволяет предсказать наблюдаемое многообразие радиобиологических эффектов на основе минимума исходных предположений.

Тем не менее, вероятностная модель, в значительной степени основанная на принципе попадания, имеет много общего с классическими моделями. В тех случаях, когда вероятность проявления повреждения равна единице, вероятностная модель переходит в классическую одноударную модель. При качественном ана­лизе экспериментальных данных, который ограничивается средними характе­ристиками популяции облученных клеток, вероятностная модель зачастую при­водит к таким же результатам, как и многоударная.

Главное отличие вероятностной модели от классических состоит в том, что согласно последним радиочувствительность клетки опреде­ляется лишь объемом мишени и критическим числом попаданий. С по­зиций же вероятностной модели проблема радиочувствительности пред­ставляется более сложной. Процесс радиационного поражения клет­ки Ю. Г. Капульцевич формально делит на три этапа.

Первый этап радиационного поражения -  осуществление событий по­падания, в результате которых формируются первичные потенциаль­ные повреждения. Вероятность образования первичного повреждения на единицу дозы облучения зависит от величины эффективного объема и от величины энергии, необходимой для образования первичного по­вреждения. Поскольку отнюдь не всякое выделение энергии в эффек­тивном объеме может привести к образованию первичного поврежде­ния, клетка, по-видимому, способна восстанавливаться еще на стадии формирования потенциальных повреждений. На этой стадии радиочувствительность определяется величиной эффективного объема (V) и вероятностью (р) образования потенциального повреждения (при ло­кальном выделении энергии в эффективном объеме). Параметры V и р могут зависеть как от биологических особенностей объекта, так и от условий облучения, например от температуры, влажности, концентра­ции кислорода и др.

Второй этап радиационного поражения — реализация потенциальных повреждений. Так как клетки способны восстанавливаться от лучевых повреждений, то реализованными оказываются не все возник­шие потенциальные повреждения, а лишь часть их (r). Следовательно, радиочувствительность клетки определяется и вероятностью реализа­ции потенциального повреждения. Все три параметра (V, р и r) опре­деляют частоту (b) реализованных повреждений на единицу дозы облучения (b = Vpr) и среднее число α реализованных повреждений при дозе D, т. е. α = bD. С помощью параметра b вероятностная модель учитывает зависимость радиобиологических эффектов от дозы облучения, ЛПЭ и продолжительности восстановления.

Третий этап радиационного поражения — различные вторичные нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, вызываемые реализацией повреждений. По-видимому, и на этом этапе возможно восстановление клеток от последствий реализованных повреждений или их компенсация, поэтому вероятность проявления реализованного повреждения не равна единице, а характеризуется величиной α, которая зависит от биологических особенностей клетки и от условий культивирования. Чем больше надежность системы, определяемая способностью клетки устранять всякие отклонения от нормы в работе внутриклеточных структур, тем меньше величина α. С помощью параметра α вероятностная модель позволяет анализировать пострадиационные модификации эффектов, не связанные с восстановлением.

Таким образом, радиочувствительность клетки, о которой судят по кривой выживания, определяется четырьмя параметрами: V, р, r, α. Эти параметры достаточны не только для описания формы кривой, но и всего многообразия проявления действия излучений на репродуктивную способность клеток, зависимость радиобиологических эффектов от условий культивирования клеток и физических характеристик излучения.

Таковы основные качества вероятностной модели, которую можно считать логическим звеном в развитии количественной радиобиологии.

Однако ни сама модель, ни производимый с ее помощью анализ реакций клеток на облучение не позволяют выявить природу повреждений, лежащих в основе этих реакций. Кроме того, нельзя забывать, что сделанные выводы справедливы только для дрожжевых клеток, что затрудняет проверку применимости вероятностной модели к описанию лучевой реакции клеток млекопитающих.

Ниже будут рассмотрены качественные концепции, характерная черта которых заключается в попытке указать конкретные биохимические процессы, определяющие биологическое действие радиации. Основная роль при этом отводится высокореакционноспособным продуктам — радиотоксинам, образующимся в биосубстрате вслед за поглощением энергии излучения и инициирующим множественные повреждения различных клеточных органелл.

Радиобиологический парадокс несоответствия малых количеств поглощенной энергии с разительным биологическим эффектом с позиций качественных гипотез объясняется наличием различных биологических механизмов усиления первичных поражений.

Еще в 50-х годах А. С. Мочалиной и Ю. Б. Кудряшовым в лаборатории Б. Н. Тарусова было обнаружено, что водно-солевые вытяжки из облученной печени при введении интактным животным вызывают гемолиз. В связи с этим было высказано предположение, что под влиянием облучения в печени образуется «гемолитический фактор». В результате его идентификации была установлена липидная природа образующегося цитотоксического агента, названного липидным радиотоксином (ЛРТ). Оказалось, что ЛРТ обнаруживается уже в первые часы после облучения не только в печени, но и в крови, тонком кишечнике, семенниках, почках, желудке и других органах животных, также этот эффект был получен на растениях и микроорганизмах.

ЛРТ представляет собой лабильный комплекс продуктов окисления жирных ненасыщенных кислот, гидропероксидов, эпоксидов, альдегидов и кетонов. Показано, что ЛРТ вызывает не только гемолиз, но и другие реакции, характер­ные для лучевого поражения: торможение клеточного деления, нарушение кроветворения, повреждение хромосомного аппарата некоторых объектов и др. В связи с этим ЛРТ был назван «естественным радиомиметиком», т. е. агентом, имитирующим биологическое действие ионизирующих излучений. Радиомиметическое действие токсических веществ липидной природы показано также в се­рии работ японских исследователей (С. Сено и др., I960; Ямамото и др., 1960; О. Юкава, 1987).

На рис. III.37 представлено содержание различных токсических про­дуктов в печени облученных крыс; видно, что в разные сроки после облучения наблюдается чаще увеличение, но иногда и уменьшение количества исследованных веществ: холина, хинонов, гистамина, про­дуктов автолиза, ЛРТ. Выясняя роль каждого из них, Ю. Б. Кудряшов показал, что введение ЛРТ интактным животным вызывало у них фазные изменения других «радиотоксинов», в том числе хинонов. Инъ­екция же хинонов или других «радиотоксинов» не приводила к обра­зованию ЛРТ. На этом основании ЛРТ были отнесены к первичным радиотоксинам, а все остальные — к вторичным.

Позднее к первичным радиотоксинам были отнесены авторами и хиноны на том основании, что и они «...способны накапливаться в клетках сразу после начала облучения как продукты первичных лу­чевых   процессов окисления биосубстратов»  (Ю. Б. Кудряшов, Г. Гончаренко, 1970).

Гипотеза липидных радиотоксинов базируется на выдвинутой Б. Н. Тарусовым и Н. М. Эмануэлем концепции о решающей роли в начальных процессах лучевого поражения цепных окислительных реак­ций свободнорадикального типа, наиболее подходящим субстратом для которых являются липиды. Так как последние представляют собой структурные элементы клеточных мембран, их поражение приводит к нарушению регуляции химизма живой клетки вплоть до уровня, приводящего ее к гибели. Возникновению цепных реакций согласно этой концепции, способствует вызываемое облучением разрушение или ингибирование природных антиокислительных (антиоксидантных) систем; в клетках, необлученных организмов они предохраняют липиды от самопроизвольного окисления.

 

Рис. III.37. Содержание различных веществ, которым приписывают роль «радиотокси­нов» в печени крыс в разные сроки после общего облучения в дозе 7 Гр (по Ю. Б. Кудряшову, Е. К. Гончаренко, 1970):

1 — холин, 2—хиноны, 3 — гистамин, 4 — белок (автолиз), 5 — ЛРТ

 

Легко заметить, что концепция ЛРТ и цепных реакций постулирует наличие в клетке мишеней в виде определенных фракций липидов, ибо именно их первичное поражение якобы способствует развитию всех последующих событий, включая и поражение генетического аппарата.

Анализ современных, экспериментальных данных не дает, однако, оснований для признания концепции ЛРТ и цепных реакций в качестве универсальной теории летального действия ионизирующих излучений на клетку.

Во-первых, аналогия в действии ЛРТ и ионизирующих излучений ограничена лишь определенным кругом явлений, но установлены и  принципиальные различия: различаются структурные повреждения хромосомного аппарата, отсутствует мутагенное действие ЛРТ. Во-вторых, цепные разветвленные реакции in vivo пока еще не зарегистрированы, а возможность их развития и длительного протекания без обрыва в живой метаболизирующей многокомпонентной структурированной системе вообще маловероятна. В-третьих, накопление ЛРТ количественно не связано с ЛПЭ, а последняя в основном определяет ОБЭ ионизирующих излучений. В-четвертых, отсутствуют четкие количественные временные характеристики зависимости эффекта поражения биосистем от интенсивности образования ЛРТ при различных дозах облучения, не говоря уже о других «радиотоксинах».

В этой связи гипотезу липидных радиотоксинов и цепных реакций следует рассматривать лишь как попытку объяснить одно звено в сложном патогенетическом комплексе лучевых реакций, удельную роль которого в лучевой гибели клетки еще предстоит оценить.

В основе теории, активно разрабатываемой А. М. Кузиным с 1965 г., лежит идея о том, что под действием ионизирующего излучения в клет­ке возникают не только чисто радиационно-химические повреждения, но благодаря биохимическим механизмам усиления в организме синте­зируются и высокореакционные продукты, приводящие к дополни­тельному повреждению биологически важных макромолекул и обра­зованию низкомолекулярных токсических метаболитов.

В рассматриваемой теории решающее значение отводится не только радиационному поражению ядерных макромолекул, но и наруше­ниям цитоплазматических структур и их нормального функциониро­вания, осуществляемого благодаря присущей им упорядоченности.

Повреждение такой строго скоординированной системы в одном или нескольких звеньях приводит к нарушениям мембран и сопряжения важных метаболических процессов: инактивации ферментов, расстрой­ству управляющих систем и другим тяжелым последствиям.

В качестве токсических метаболитов особая роль, как и в предыдущей гипотезе, придается опять же первичным радиотоксинам (ПРТ), которыми теперь «... называют вещества, образующиеся в клетках об­лученных организмов тотчас или в ближайшие часы после облучения и обладающие свойством вызывать основные радиобиологические эф­фекты при действии на клетки или организмы» (А. М. Кузин. 1970, 1986). Множество «радиотоксинов», образующихся на поздних стадиях лучевого поражения, в отличие от ПРТ имеют в рамках этой гипоте­зы вторичное происхождение. Хотя им и отводится важная роль в исходе поражения организма, они не существенны для понимания пер­вичных процессов.

Полагают, что ПРТ — комплекс веществ, которые обладают близкими свойствами, хотя и относятся к различным классам химических соединений. Одни из них всегда существуют и в нормальной клетке, но в меньшем количестве, чем после облучения.

Работами А. М. Кузина и его сотрудников показано, что в водных или спиртово-водных вытяжках из облученных растительных объектов увеличивается содержание веществ, которые идентифицированы как хиноны или ортохиноны. По данным этих авторов, введение экстрактов из облученных объектов (например, картофеля) приводит к снижению массы животных, угнетению клеточного деления и возникновению хромосомных аберраций в клетках корешков растений, подавлению роста клеточных культур, увеличению числа уродств личинок вьюна и частоты мутаций у Е. coli. Те же изменения, но значительно менее выраженные, появляются при введении экстрактов из необлученных растений.

Нарастание концентрации хинонов в клетках после облучения носит экспоненциальный характер, что в совокупности с данными токсикологических исследований, где также наблюдается линейная зависимость между временем воздействия яда и логарифмом выживаемости (например, гибель микроорганизмов в растворе фенола), используется А. М. Кузиным для критики классической теории мишени, отвергающей роль ядов в радиобиологическом эффекте.               

В монографии «Структурно-метаболическая теория в радиологии» (1986) сделана попытка анализа многочисленных фактов, накопленных радиобиологией за текущие десятилетия. В этой книге автор приходит к заключению, что «структурно-метаболическая теория является общей теорией действия радиации на биологические объекты, начиная с клеточного уровня и кончая высокоорганизованными многоклеточными организмами». Эта теория «рассматривает механизмы как поражающего действия сублетальных и летальных доз радиации, так и стимулирующего действия малых доз радиации. Она применима и при исследовании синергизма действия ионизирующей радиации с другими физическими и химическими факторами».

Объективно оценивая предпринятый гигантский труд, нельзя не отметить, что, несмотря на солидный объем монографии, в ней так и не удалось сформулировать смысл теории или хотя бы изложить ее конкретные принципы.

Автор утверждает: «Структурно-метаболическая теория исходит из дискретного характера передачи энергии ионизирующих излучений молекулам и структурам клетки, возможного неравномерного распределения поглощенной энергии в облучаемой клетке или популяции клеток и использует «принцип попадания» только в его строго физическом смысле». Опустив весьма сомнительную правомерность объединения неравномерности распределения энергии в отдельной клетке и популяциях, легко видеть, что здесь по существу изложено первое положение теории мишени — принцип попадания, четко сформулированное шестьюдесятью годами ранее.

Ее второе положение — принцип мишени, учитывающий высокую гетерогенность клетки в морфологическом и функциональном отношениях, «затерялось» в следующем тексте: «Структурно-метаболическая теория, исходя из гетерогенности и неоднозначности субклеточных структур и учитывая внутриклеточные связи и зависимости, отмечает ведущую роль в формировании радиобиологических эффектов — нарушений, возникающих в клеточном ядре (геноме) и биомембранах, в генерации энергии и изменении уровня низкомолекулярных биологически активных веществ (радиотоксинов)».                                                Структурно-метаболическая теория не может быть признана универсальной теорией биологического действия излучения по ряду причин. Прежде всего, не определены количественные соотношения между накоплением ПРТ в клетке и степенью ее поражения, а сам по себе факт экспоненциального роста содержания ПРТ с увеличением дозы и во времени, наблюдавшийся на отдельных объектах, не может претендовать на какую-либо однозначную интерпретацию.

Вряд ли в свете современных данных можно согласиться с ведущей ролью ПРТ в первичных процессах радиационного поражения клетки, если время образования токсинов, согласно определению, смещается от момента облучения к ближайшим часам и даже нескольким суткам после облучения. К сожалению, даже в упоминаемой монографии автора теории (1986), обобщающей многолетний путь формирования его пред­ъявлений о механизме лучевых повреждений, стохастические теории лишь упоминаются, а классические положения теории мишени по-прежнему критикуются без достаточных оснований, не учитывая того, что они адресованы определенному и совершенно другому классу яв­лений.

Более того, «в вину» теории мишени ставится и концепция «потенциальных повреждений». Между тем, как было изложено выше, понятие потенциальных повреждений привело к открытию таких фундаментальных радиобиологических феноменов, как по­тенциальные летальные и сублетальные повреждения, а главное, к открытию наиболее важного радиобиологического явления — репарации клеток. Открытие репарации - феномена, который не был известен создателям теории мишени, наполнило конкретным молекулярно-радиобиологическим содержанием такие вынужденные формальные понятия, как «эффективный объем», что лишь проде­монстрировало эвристический характер классического форма­лизма. И всё же, подводя итог современному состоянию радиобиоло­гической теории, следует признать, что классические представления принципа попаданий претерпели серьезную модификацию. Стала очевидной наряду с ролью повреждения и репарации ДНК важность повреждений и в других звеньях многокомпонентной строго упоря­доченной в структурном и функциональном отношении системы, ка­ковой является живая клетка. Отсюда создание единой теории радио­биологического эффекта — дело будущего, ибо оно непосредственно связано с познанием молекулярных основ жизни.

Итак, рассмотрены основные вопросы общей радиобиологии, включая ее физические основы, содержание предмета и метода его изучения, а также теории действия ионизирующих излучений на клетку. Полученная читателем информация о многогранности проявлений радиобиологического эффекта окажется необходимой при изучении любого частного раздела радиобиологии, в том числе и радиобиологии организма, которой посвящена вторая часть учебника.

Дискуссионность и недостаточная изученность многих вопросов, ни в какой степени не должны послужить причиной пессимизма. Напротив, они лишь ориентируют на необходимость и перспективность дальнейших исканий, результаты которых, а особенно время рождения принципиально новых данных, предсказать невозможно. И, тем не менее, имеющийся опыт свидетельствует о том, что прикладные, полезно используемые человеком возможности радиобиологии всегда основывались на фундаментальных научных достижениях. Следовательно, и практические перспективы радиобиологии будущего зависят, прежде всего, от успехов в решении ее общих вопросов.

В этом отношении не существует мелочей; количественное накопление самых незначительных, на первый взгляд, фактов в конечном итоге неизбежно приводит к качественному скачку. Разумеется, бездумное накопление фактов не должно быть самоцелью. Эксперимент должен базироваться на определенных принципах, знание которых, как говорили древние, иногда даже компенсирует незнание некоторых фактов. Отсюда, с одной стороны, — роль теоретических построений, с другой, напротив, — значение кардинальных фактов, либо не укладывающихся в прокрустово ложе устоявшихся представлений, либо их ниспровергающих, порождая тем самым новые плодотворные идеи.

 

В чем суть принципов попадания и мишени?

Как с позиций теории мишени интерпретируются основные параметры кривых доза — эффект?

Назовите границы применения теории мишени. В чем суть стохастической теории, ее сходство и отличие от мишени?

Изложите смысл вероятностной гипотезы.

Как понимается механизм биологического действия ионизирующих излучений с позиций гипотезы липидных радиотоксинов и структурно-метаболической теории?

В чем состоят ограничения качественных подходов к интерпретации механизма радиобиологического эффекта?

 

 

«Порядок и последовательность нужнее великих дарований для того, чтобы хорошо управлять».

О. Мирабо

 

§6 Радиочувствительность тканей, органов, организмов

 

Закономерности поражения целост­ного организма определяются дву­мя факторами: 1) радиочувствительностью тканей, органов и сис­тем, существенных для выживания организма; 2) величиной поглощен­ной дозы облучения и ее распреде­лением в пространстве и времени.

Каждый в отдельности и в сочетании друг с другом эти факторы определяют преимущественный тип лучевых реакций (местные или общие), специфику и время проявления (непосредственно после облучения, вскоре после облучения или в отдаленные сроки) и их значимость для организма.

Следует иметь в виду, что при переходе от изолированной клетки к ткани, к органу и организму все явления усложняются. Эго происходит потому, что не все клетки поражаются в равной степени, а тканевой эффект не равен сумме клеточных эффектов: ткани, а тем более органы и системы нельзя рассматривать как простую совокупность клеток. Находясь в составе ткани, клетки в значительной степени зависимы и друг от друга, и от окружающей среды. Митотическая активность, степень дифференцированности, уровень и особенности метаболизма, а также другие физиологические параметры отдельных клеток не безразличны для их непосредственных «соседей», а, следовательно, и для всей популяции в целом. Общеизвестно, например, что заживление раны происходит вследствие временного ускорения размножения оставшихся клеток, обеспечивающего рост ткани и замещение вызванных травмой тканевых утрат, после чего тип клеточного деления нормализуется.

В механизме таких стимулирующих и ингибирующих влияний, испытываемых клетками, принимают участие не только локальные факторы, но и регулирующие системы, поддерживающие состояние гомеостаза в организме. Нет оснований сомневаться в важной роли тех же процессов в реализации тканевых и системных реакций на облучение. Кроме того, на тканевую радиочувствительность оказывают большое влияние и другие факторы: степень кровоснабжения, величина облучаемого объема и др. Таким образом, радиочувствительность ткани нельзя рассматривать только с позиций составляющих ее клеток без учета морфофизиологических факторов. Например, эритробласты изменяют свою радиочувствительность в зависимости от места их нахождения в организме — в селезенке или костном мозге. Разную радиочувствительность имеют также одна и та же опухоль, привитая в разные органы, и ее метастазы, в зависимости от их локализации.

Все это усложняет оценку радиочувствительности тканей, органов и целого организма, но не отвергает принципиального и ведущего значения цитокинетических параметров, определяющих тип и выраженность лучевых реакций на всех уровнях биологической организации.

Самый типичный пример радиационного поражения организма животных и человека — острая лучевая болезнь, возникающая после равномерного тотального однократного внешнего облучения. В этом случае одновременно подвергаются радиационному воздействию все системы, органы, ткани и клетки в одинаковой дозе. Наилучшее понимание основных проявлений лучевого поражения организма может быть достигнуто сопоставлением их с поглощенной дозой в «критических органах».

Под критическими органами понимают жизненно важные органы или системы, первыми выходящие из строя в исследуемом диапазоне доз облучения, что обусловливает гибель организма в определенные сроки после облучения.

Таким образом, между величиной поглощенной дозы в организме и средней продолжительностью жизни существует строгая зависимость, определяемая различиями в радиочувствительности отдельных жизненно важных (критических) систем.

Еще в 40-х годах исследованиями Б. Раевского и Г. Квастлера было обнаружено, что в определенных диапазонах, несмотря на увеличение дозы, средние сроки гибели мышей не меняются. Соответствующая кривая, описывающая зависимость средней продолжительности жизни мышей от дозы облучения, состоит из трех участков (рис. III.38). Начальный участок охватывает период от нескольких недель до нескольких дней и соответствует дозам до 10 Гр. Далее следует плато, где средняя продолжительность жизни не изменяется, несмотря на увеличение дозы от 10 до 100 Гр. На третьем участке показано, что при последующем увеличении дозы средняя продолжительность жизни снова резко укорачивается от нескольких дней до нескольких часов. Рассмотренные участки кривой отражают основные клинические синдромы - костномозговой (кроветворный), желудочно-кишечный и церебраль­ный, развивающиеся вслед­ствие необратимого пораже­ния соответствующих крити­ческих систем организма — кроветворной, кишечника и ЦНС.

 

Рис. III.38. Зависимость средней продолжительности жизни мышей после однократно­го рентгеновского облучения от дозы (двойная логарифмическая шкала) (по Б. Раевскому, 1954)

 

Ступенчатый характер от­мирания, связанный с выхо­дом из строя критических систем, к настоящему вре­мени обнаружен для самых разнообразных живых объек­тов (рис. III.39).

Рис. III.39.     Зависимость средней продолжительности жизни млекопитающих от дозы облучения (1) и ее отклонения (2, 3), полученные разными авторами   на   мышах, крысах, хомячках, морских свинках и обезьянах (по В. Бонду и др., 1971)

 

Показано (И. Б. Бычковская, 1970) наличие такой закономер­ности для земноводных (лягуш­ки), насекомых (амбарные долго­носики, бокоплавы, дрозофилы), червей и даже растений.

Таким образом, ступенчатая зависимость времени наступления гибели самых разнообразных объектов от дозы, отражающая многосистемность в реакции на облучение, — общебиологическая за­кономерность. Разрыв между дозами, начинающими вызывать определенные формы гибели, указывает на разницу в радиочувствительности ответственных систем (по критерию поражения, несовместимого с жизнью).

Наличие плато на кривой (рис. III.39) свидетельствует о пороговости регистрируемого эффекта, поэтому несовместимое с жизнью повреждение той или иной системы наступает по достижении определенного уровня поражения, т. е. имеет пороговый характер. Области перегиба кривой соответствуют дозам, при которых возможны те или другие формы гибели вследствие индивидуальных вариаций радиочувствительности смежных систем.

Аналогичное изменение средней продолжительности жизни, определяемое дозой облучения, показано и для человека. На рис. III.40 хорошо видны три области насыщения эффекта. Основываясь на клинической картине поражения, их связывают с теми же тремя патогенетическими механизмами поражения, приводящими организм к гибели. При дозах облучения, когда средняя продолжительность жизни не превышает 40 сут, на первый план выступает нарушение гемопоэза; при больших дозах (продолжительность жизни около 8 сут) ведущими становятся проявления поражения кишечника, а при еще больших ( > 30 Гр; продолжительность жизни ~ 2 сут и менее) развиваются церебральные симптомы.

 

Рис. III.40. Зависимость средней продол­жительности жизни человека и обезьян от дозы облучения (полулогарифмичес­кая шкала) (по Р. Аллену и др., 1960)

 

Состояние устойчивого динамического равновесия любой клеточной популяции в живом организме, необходимое для нормальной жизнедеятельности, поддерживается системами обновления кле­ток; любая потеря клеток (вследствие их гибели или миграции) в системе коли­чественно восполняется возникновением новых кле­ток, что обеспечивает не­изменность функции. Клетки каждого типа имеют свою характерную для них про­должительность жизненного цик­ла и соответственно различаются темпом обновления.

Таким образом, взрослый организм постоянно находится в состоянии строго сбалансированного клеточного самообновления, происходящего непрерывно в ряде его  жизненно важных систем.

Ежеминутно в каждой из них отмирают десятки и сотни тысяч «отслуживших» клеточных элементов, заменяясь новыми, заведомо готовыми «пожертвовать» собой через строго определенный срок - и так до конца жизни организма. Такое устойчивое равновесие в системах клеточного самообновления, являющееся необходимым  условием надежности поддержания жизнеспособности организма, получило название клеточного гомеостаза.

Применительно к рассмотренным выше основным радиационным синдромам две из таких самообновляющихся систем (в основном определяющие выживание или гибель облучаемого организма) — кроветворная и желудочно-кишечная — характеризуются большой скоростью клеточного обновления. В третьей — ЦНС — у половозрелых животных и у взрослого человека клеточного обновления практически не происходит.

Костный мозг обладает крайне высокой радиочувствительностью,  в связи с чем поражение системы кроветворения всегда наблюдается в той или иной степени при общем облучении как его типичное проявление. Поэтому на примере костного мозга будут рассмотрены общие принципы функционирования самообновляющейся системы, которые в полной мере сохраняют свое значение для любой другой системы клеточного обновления.

Основное назначение костного мозга — продукция зрелых высокодифференцированных клеток крови. В нормальных условиях гибель или исчезновение каждого клеточного элемента в периферической крови или в другом участке организма компенсируется образованием в среднем одной клетки в костном мозге.

По меткому выражению В. Бонда, костный мозг представляет собой «фабрику», производящую клетки, а периферическая кровь -  «службу сбыта» организмом уже зрелых элементов.

 

Рис. III.41. Модель системы клеточного обновления (по В. Бонду и др., 1971)

Время, указанное в нижней части рисунка, отражает порядок величин, характерных для гранулоцитопоэза млекопитающих, в том числе и чело­века

 

На рис. III.41 изображена упрощенная модель системы клеточного обновления применительно к мнелопоэзу, состоящая, как и любая система клеточного обновления, из нескольких пулов. Прежде всего, это самоподдерживающийся фонд недифференцированных предшественников — стволовых (клоногонных) клеток, способных обеспечить постоянную скорость клеточного обновления в системе. При делении стволовых клеток часть их потомства предназначается для последующей дифференциации в специфические клеточные линии, а оставшиеся служат новыми стволовыми клетками.

Пройдя одно или несколько делений, клетка постепенно дифференцируется, затем, утратив способность делиться, входит в непролиферирующий пул, где окончательно созревает и становится функционально полноценной. Ясно, что цитокинетика той или иной системы обновления предопределяется уровнем митотической активности и продолжительностью отдельных фаз клеточного цикла.

Общий принцип, обеспечивающий устойчивую работу любой системы клеточного обновления (имеется в виду поддержание ее в со­стоянии количественного и качественного динамического равнове­сия), состоит в том, что по мере отмирания и удаления зрелых клеток из функционального пула вместо каждой из них поступает новая, находящаяся в этот момент на стадии максимальной подготовленности.

Таким образом, функционирующая система самоподдерживается из-за необходимости восполнения постоянно происходящих утрат, являющихся своеобразным стимулом к активации всех предшествующих пулов, в результате чего и осуществляется перманентное клеточное обновление.

Под действием излучения в любой клеточной системе обновления происходят резкие нарушения динамического равновесия между отдельными пулами, приводящие к тяжелым функциональным расстройствам в самой системе, а в зависимости от ее значения для жизнедеятельности и к соответствующим последствиям в организме.

Качественное представление о механизме этих нарушений следует из анализа реакций облученных клеток, закономерности которых в целом сохраняются и для тканевых систем в живом организме. Это основные радиобиологические реакции клеток, определяющие типичные нарушения в любой системе обновления.

 

 

Рис. III.42. Эффекты, возникающие в системе клеточного обновления вследствие внезапного опустошения самых ранних пролиферирующих компонентов в результате облучения (по В. Бонду и др., 1971)

 

  1. Временное прекращение деления всех клеток независимо от того, какая из них выживет в последующем.
  2. Гибель молодых, малодифференцированных и делящихся клеток.
  3. Минимальные изменения продолжительности процесса клеточного созревания, а также времени жизни большинства зрелых клеток и скорости притока их в функциональный пул.

В результате три первых пула начинают опустошаться сразу и в ближайшие дни после облучения, а число соответствующих зрелых функционирующих клеток уменьшается значительно позднее, когда их естественная убыль перестает восполняться из-за опустошения предшествующих пулов (рис. III.42). Эта задержка определяется временем, необходимым клетке для прохождения пути от самых ранних стадий до выхода в функциональный пул. Количественные характеристики указанных нарушений определяются конкретными цитокинетическими параметрами той или иной системы обновления и дозой облучения.

Радиационные нарушения мнелопоэза мыши, качественно аналогичные изменениям, происходящим в последовательно связанных пулах у любой системы клеточного обновления (для случая, если опустошены более ранние компартменты), схематически показаны на рис. III.42.

С этих позиций следует несколько подробнее проанализировать радиационные изменения в системе кроветворения, так как именно с ними наиболее часто приходится встречаться на практике: при облу­чении в дозах до 10 Гр в организме развивается типичный костномозговой синдром.

Основная причина катастрофического опустошения костного мозга, происходящего в самые ранние сроки после облучения, состоит в резком торможении процессов клеточного деления при продолжающемся с неизменной скоростью поступлении зрелых элементов на периферию.

Внешне парадоксален, но несомненен тот факт, что на кинетике этого процесса не сказывается доля летально поврежденных клеток, увеличивающаяся с дозой облучения. Определяется это тем, что скорость клеточного опустошения костного мозга в первые сутки при всех дозах изучения одинакова, вследствие чего она описывается одной экспонентой (рис. III.43). Очевидно, вследствие сохранения скорости выхода клеток на периферию в общем «потоке» с жизнеспособными клетками выходят в кровь и летально поврежденные.

Рис. III.43. Изменение общего числа клеток костного мозга крысы после облучения в дозах 3—10 Гр

 

Опустошение «фабрики», отражающее, по существу, нормальную скорость выхода зрелой «продукции», сохраняет экспоненциальный характер лишь до начала регенерации. Наблюдающееся затем восста­новление происходит с различной скоростью, обратной величине дозы (см. рис. III.43). Здесь-то и сказывается разная степень клеточной дест­рукции, определяющая глубину лейкопении, а, следовательно, тече­ние и исход лучевого поражения организма.

Рассмотренная схема дает лишь общее представление о цитокинетике изменений в обоих компартментах кроветворения на основе принци­пиальных механизмов саморегуляции, типичных для систем клеточного обновления. В зависимости от объекта и дозы облучения параметры кривых имеют свои количественные характеристики и некоторые качественные особенности.

 

 

Рис. III.44. Число нейтрофилов перифе­рической крови свиньи в разное вре­мя после облучения (по В. Бонду, 1974):

цифрами обозначены дозы облучения:

1 - 2 Гр, 2 - 3 Гр, 3 - 4 Гр, 4 — 6 Гр;

следует обратить внимание на начальное «плечо», быстрый спад, временный абор­тивный подъем и затем постепенное окон­чательное восстановление

 

Для примера на рис. III.44 приведены изменения в наиболее ответствен­ном звене — гранулоцитах — у подвергнутых тотальному облучению свиней. Кривую, отражающую наблюдения в течение 120 сут, можно разделить на три участка: 1) фазу дегенерации, характеризующуюся небольшим порогом и быстрым спадом; 2) фазу абортивного подъема с последующим еще большим спадом; 3) фазу восстановления до исходного уровня.

Особенности фазы дегенерации связаны с рассмотренными выше радиобиологическими закономерностями. Протяженность «плеча» определяется временем от последнего деления в пуле делящихся (созревающих) клеток костного мозга (см. рис. III.42) до выхода зрелых элементов в периферическую кровь. Отсюда следует, что созревание клеток, оставшихся жизнеспособными (по крайней мере, при среднелетальных дозах), происходит с нормальной скоростью. Наклон экспоненциального участка кривой определяется временем исчезновения нормальных клеток из периферической крови, что совпадает с быстрым и почти полным прекращением поступления нормальных клеток из костного мозга вследствие его глубокого опустошения.

Клетки, остающиеся в периферической крови, элиминируются с  нормальной скоростью. С увеличением дозы облучения наклон этого участка кривой все более приближается к характеристикам исчезновения из крови нормальных клеток; при меньших дозах небольшое количество клеток продолжает выходить на периферию, имея различные повреждения, так как они — потомки не летально поврежденных делящихся и созревающих элементов. Следовательно, в фазе дегенерации в крови находятся только поврежденные клетки.   

Фаза абортивного подъема позволяет организму жить в течение более длительного времени, чем можно было бы ожидать. Механизм абортивного подъема еще неясен. Наиболее вероятно, что он связан с размножением в разной степени поврежденных радиацией клеток пролиферативного (усиливающего) пула, обладающих ограниченной способностью к самоподдержанию, и отчасти полипотентных стволовых клеток. По степени повреждения клетки этих пулов могут полностью сохранить пролиферативную  способность, иметь сниженные пролиферативные потенции или оказаться необратимо поврежденными.

Абортивный подъем вероятнее всего обеспечивается клетками со сниженной пролиферативной способностью, продолжающими деление еще некоторое время. Лишь, после того как ограниченный потенциал пролиферации этих клеток будет исчерпан (они сами и все их потомки погибнут), число зрелых элементов вновь снизится до минимального уровня. Окончательная регенерация в основном осуществляется клетками, сохранившими не­изменной пролиферативную способность.

 

 

Рис. III.45. Объяснение абортивного подъема числа клеток (по В. Бонду. 1971):

1 — отмирающие (сильно поврежденные) клетки, быстро исчезающие из системы; 2 — «поврежден­ные» клетки (некоторое время пролиферируют, но через несколько делений вымирают и они и их потомство); 3 — общее количество клеток; 4 — вы­жившие клетки, способные пролиферировать неограниченно долго

 

На рис. III.45 схематически представлено   изображение абортивного подъема, соот­ветствующее возможному объ­яснению этого явления. Пра­вильное понимание его меха­низмов весьма важно, ибо аналогичные явления встре­чаются и при облучении дру­гих клеточных популяций.

В частности, такую природу имеет временно продолжающийся рост опухолей после облучения в дозах, вызывающих гибель практически всей клеточной массы.

Фаза восстановления обеспечивается лишь небольшим количеством стволовых клеток, сохранившихся в костном мозге после глубокого начального опустошения и обладающих способностью к неограничен­ному размножению. Они должны не только продуцировать увеличен­ное количество подобных себе элементов, необходимых для репопулирования пула костномозговых стволовых клеток, но и производить дифференцирующиеся клетки, предназначенные для последующего созревания и поступления в кровь. Эти требования к небольшому числу оставшихся неповрежденными стволовых клеток объясняют причину задержки поступления зрелых элементов на периферию, несмотря на то, что в период резкой нейтропении в кровь поступает очень небольшое количество нейтрофилов. Только когда пул стволовых клеток су­щественно разовьется, ощутимая его часть может быть направлена на созревание. В результате в начале фазы восстановления число клеток крови увеличивается медленно, затем скорость выхода зрелых клеток в кровь нарастает, достигая нормальной величины в разгар восстановления.

Выше были рассмотрены основные радиационные синдромы и проанализирована цитокинетика поражений в критических системах клеточного обновления, из которых кроветворная система и кишечник - типичные примеры радиочувствительных тканей со свойственной им активностью физиологической пролиферации, а ЦНС — яркий пример непролиферирующих высокодифференцированных клеточных систем, являющихся, поэтому радиорезистентными.

Проведенный анализ позволяет следующим образом связать изменения, происходящие на уровне клеточных популяций, с исходом острого лучевого поражения после тотального облучения. Общая реакция млекопитающих как функция дозы и времени после об­лучения определяется четырьмя кардинальными параметрами клеточных популяций: величиной пула стволовых клеток, радиочувствительностью клеток и способностью их к восстановлению (определяющими характер дозовых кривых), клеточной пролиферацией и длительностью функционирования зрелых элементов.

С этих позиций достаточно надежно могут быть предсказаны события, которые произойдут при облучении различных областей тела, если известны клеточно-кинетические параметры облучаемых тканей, что весьма важно для оценки эффектов локального облучения, а также при планировании курса лучевой терапии опухолей и прогнозировании ее последствий.

Эндокринные железы. Железы внутренней секреции относят к радиорезистентным, хотя реакции эндокринной системы на общее облучение общеизвестны. Так же как в отношении нервной системы, очень трудно отдифференцировать, являются ли эти реакции результатом не­посредственного повреждения эндокринных желез или отражением воздействия излучения на другие системы и весь организм. Можно предположить, что наблюдаемые после общего облучения нарушения баланса гормонов, особенно щитовидной железы, надпочечников и гонад, могут быть следствием реакции гипоталамо-гипофизарной системы, учитывая тесную взаимосвязь между тирео-, адрено- и гонадотропными факторами гипофиза.

 

Рис. III.46. Зависимость числа клеток с хромосомными аберрациями (%) от дозы облуче­ния:

а - в костном мозге мышей, б - в печени крыс; 1 - рентгеновское излучение 180 кВ, 2 - γ-излучение 60Со, 3 - протоны 600 МэВ

 

Следствием таких скрытых повреж­дений, возникающих в клетках любых малообновляющихся тканей (в отличие, например, от костного мозга), не элиминируемых в процессе деления, являются, в частности, и различные осложнения лучевой терапии. К их числу относятся миетиты, циститы, ректиты, пульмониты, перихондриты, поражения по­чек, сердца, печени, а возможно и злокачественные опухоли.

Сравнивая радиочувствительность отдельных тканей, следует при­менять только адекватные критерии. Например, для таких, ка­залось бы, разных по радиочувствительности органов, как кост­ный мозг и печень, индукция хромосомных аберраций, возника­ющих под действием эквивалентных доз облучения, почти одина­кова (рис. III.46). Если же в качестве показателя лучевого пораже­ния использовать не непосредственные, а отдаленные последствия, то для этих органов они будут сильно различаться. Следовательно, понятие радиочувствительности применительно к той или иной ткани, органу или системе весьма относительно.

Сравнение радиочувствительности различных тканей свидетельствует о том, что радиочувствительность организма млекопитающих можно связать с радиочувствительностью костного мозга, ибо именно его аплазии, возникающей при тотальном облучении, вполне достаточно для гибели организма.

Под радиочувствительностью организма обычно понимают диапазон доз, вызывающих гибель животного при явлениях костномозгового синдрома.

 

Рис. III.47. Кривая смертности мышей, подвергнутых общему рентгеновско­му облучению (каждая точка полу­чена для 20 животных) (по И. Томсону, 1964)

 

Для количественного изучения радиочувствительности организма используют кривые выживания или смертности, при построении которых на оси абсцисс откладывают дозы облучения, а на оси ординат — процент гибели в определенного срока наблюдения (чаще всего за 30 сут).

(Сравнение критериев радиочувствительности клеточной популяции и животных показало, что параметры, обычно используемые для характеристики клеток (D0 и n), можно формально применить и для целого организма. Однако в этом случае они теряют первоначальное смысловое значение. К этому заключению пришел В. Бонд в результате анализа кривой выживания, построенной по данным опытов с облучением 4300 мышей в дозах 2—34 Гр.)

Для всех видов млекопитающих такая кривая всегда имеет S-образную форму. Это объясняется тем, что при облучении в начальном диапазоне доз гибели не наблюдается (вплоть до так называемой «минимально летальной дозы» — на рис. III.47 это 4 Гр), а, начиная с некоторой дозы («минимальной абсолютно летальной дозы» — на рис. III.47 это 9 Гр) погибают все животные. Так как вся смертность регистрируется в интервале между этими дозами, на этом отрезке кривая круто поднимается вверх, приближаясь к 100%. В качестве примера на рис. III.47 приведена кривая смертности, характеризующая радиочувствительность мышей линии CF1.

По кривой выживания можно оценить дозы, вызывающие гибель любой доли животных. Неправомерно лишь согласно теории использовать термин ЛД100, ибо гибель конкретного животного зависит от вероятности многих событий, а потому в принципе выживание отдельных особей возможно и при «абсолютно летальных» дозах.

Наиболее пригодным и чаще всего употребляемым показателем радиочувствительности организма является ЛД50, которую легко определить по графику; видно (рис. III.47), что в этой области данные наиболее точны из-за большой крутизны кривой.

Из данных рис. III.47 видно, что, несмотря на большую статистическую нагруженность эксперимента (более 500 животных) наблюдается достаточно большой разброс значений выживаемости при одинаковых дозах облучения. Это определяется высокой вариабельностью индивиду­альной радиочувствительности (даже для животных одной линии) и влиянием неконтролируемых условий эксперимента. Приведенный пример показывает, насколько весомым должен быть экспериментальный материал для того, чтобы сделать уверенное заключение о таком ин­тегральном показателе, как радиочувствительность организма.

 

Рис. III.48. Обработка данных, при­веденных на рис. III.47, в координа­тах пробит - логарифм дозы (кривая 1, кружки) и пробит - доза в арифметической шкале (кривая 2, треугольники):

как и на рис. III.47, данные но дозам, вызывающим гибель 50% животных, более точны, чем по дозам, вызывающим большую или меньшую смертность

 

Рис. III.48 иллюстрирует результат сравнительной обработки данных, приведенных на рис. III.47, в двух системах координат. Видно, что между установленными значениями ЛД50, разница весьма незначитель­на.

Из рассмотренных представле­ний о костном мозге как системе клеточного обновления, состояние которой определяет исход пораже­ния в диапазоне среднелетальных доз, следовало ожидать, что общая радиочувствительность организма коррелирует с радиочувствительностью пула стволовых клеток и их способностью к репопуляции, ответственной за репопуляцию всей кроветворной системы.

В многочисленных исследованиях, проведенных разными авторами, это предположение не подтвердилось. В частности, получена достоверная количественная корреляция между характером восстановления пула стволовых клеток мышей и восстановлением организма, определяемым по критерию выживания (см. рис. ?).

Подобная корреляция является не единственным доводом в пользу представлений о том, что выжившие после общего облучения стволовые клетки критических систем являются своеобразными детерминантами выживаемости организма. Так, показано, что лечебный эффект костного мозга или клеток других гемопоэтических органов при трансплантации их летально облученным животным полностью определяется содержанием в нем стволовых клеток. Например, для достижения одинакового с костным мозгом лечебного эффекта надо брать в 10 раз больше клеток селезенки, которые содержат в своей популяции в 10 раз меньше стволовых кроветворных клеток. Клетки лимфоузлов или тимуса, среди которых практически нет стволовых кроветворных клеток, неэффективны при лечении острого лучевого поражения.

Как показали Д. Тилл и Е. МакКуллох (1961), радиочувствительность элементов костного мозга, определяющих его терапевтическое действие, и радиочувствительность так называемых кроветворных колониеобразующих единиц (КОЕ), обладающих всеми свойствами стволовых кроветворных клеток, одинакова. Радиозащитное действие многих препаратов по тесту числа КОЕ и по 30-дневной выживаемости животных также довольно близко. Одинаковые изменения в выживаемости стволовых клеток и организма отмечены и при модификациях воздействия, например при изменении мощности дозы, фракционировании (см. рис. ?), использовании излучений, различных по ЛПЭ.

Таким образом, клеточным субстратом, ответственным за выживание организма, является пул стволовых клеток системы клеточного обновления, критической в данном интервале доз.

Рассматривая с этих позиций наиболее вероятные причины вариабельности индивидуальной радиочувствительности животных, можно предположить, что они связаны либо со статистической вероятностью поражения, а, следовательно, и выживания большего или меньшего числа стволовых клеток, либо с различиями в их числе, либо, наконец, определяются различиями в собственной радиочувствительности стволовых клеток.

Кроме индивидуальных, существуют половые (самки, как правило, менее чувствительны к облучению) и возрастные различия в радиочувствительности организма.

На рис. III.49 приведены данные о ЛД50 у мышей в течение жизни; радиочувствительность в первые 2-3 недели после рождения наиболее высока, затем снижается, выходя на плато в половозрелом состоянии, и вновь повышается в последний период жизни.

 

 

Рис. III.49. Зависимость величины ЛД50/50 от возраста мышей линии SAS/4 (по М. Кроссфилу и др., 1959)

 

 

Таблица 7. Величины среднелетальных доз при средней продолжительности жизни 30, 8, 5 и 2 дня для животных различных видов и человека (по В. Бонду и др., 1971)

 

Объект

исследования

 

Вид

излучения

и энергия, кэВ

Среднелетальные

дозы облучения

ЛД50/20

ЛД50/8

ЛД50/5

ЛД50/2

Мышь

X[1], 200

6,4

-

12,5

180-400

Мышь

(стерильная)

X, 250

7.0

 

20

 

Крыса

X, 250

7,1

-

8,0

200-300

Морская

свинка

X, 200

4,5

15

60

Хомяк

X, 200

6,1

10

200

 

X, 250

8,6

Кролик

X, 250

7,5

-

Козел

X, 200

2,4

-

 

γ-Нейтронный

источник

-

20

250

Свинья

X, 103

2,5

-

-

220

Осел

Х, 103

2,5

 

γ-Нейтронный

источник

3,7

Собака

X, 250

2,5

-

13

-

Macaco

mulatu

γ, 103

-

15

-

100

Macaco

rhesus

γ, 103

-

10

-

50

Человек

γ-Излучение

3,0

-

-

-

 

Таким образом, в основе различий в выраженности двух основных радиационных синдромов, вызванных редко- и плотно ионизирующим излучениями, в конечном счете, лежат свойственные стволовым клеткам критических систем различия в способности репарировать радиационные повреждения.

Функционирование соответствующих детерминантных клеточных элементов показано и в других системах клеточного обновления — коже, сперматогенном эпителии и в некоторых опухолях. Луче­вая реакция этих систем, особенно на этапе восстановления по­пуляции, во многом определяется фондом жизнеспособных ство­ловых клеток. Все это дает основание свести межвидовые и индивидуальные различия в радиочувствительности организма млекопитающих к особенностям кинетики клеточных популяций критических систем, детерминантами, поражения которых в основном являются соответствующие стволовые клетки.

На одном из недавних международных симпозиумов, специально посвященных сравнительной клеточной и видовой радиочувствительности было подчеркнуто, что пока еще не удается установить ясные и определенные причины раз­личий в радиочувствительности, которая даже среди млекопитающих различается в 10 раз. (Последнее десятилетие не внесло ничего принципиально нового в этот вопрос). В заключительном слове крупнейшего специа­листа в этой области В. Бонда были подчеркнуты три обстоятельства.

 

Рис. III.50. Кривые выживания стволовых клеток кишечника (1) и стволовых кроветворных клеток (2) мышей при γ-облучении; 3 и 4— то же, при облучении нейтронами (по А. Г. Коноплянникову. 1982)

 

  1. Необходимость тща­тельного изучения различий в размерах пулов клеток, кинетики и механизмов регуляции клеточной пролиферации у организмов различных видов, а также определения физиологических параметров, особенно длительности жизни зрелых функциональных клеток у облученных животных по сравнению с нормальными.
  2. Важность   изучения возможной роли изменения кровеносных сосудов, стромы пролиферирующих органов, а также других соматических тканей, повреждения которых также могут приводить организм к гибели или способствовать ее наступлению.  
  3. Важность учета пространственного распределения доз в тканях. Видимые различия в радиочувствительности могут быть просто результатом различий дозиметрических параметров облучения (т.е. ситуации, приведенной в табл. 6).

 

Нельзя потушить пламя, если лить воду только в середину огня.

Г. Ришар

 

§7 Биологическое действие инкорпорированных радионуклидов

 

В атомную эру человек может подвер­гаться не только дополнительному внеш­нему облучению, но и воздействию инкорпорированных радиоактивных веществ. Этот последний вид воздействия в про­фессиональных условиях приобретает преимущественное значение. Здесь будут рассмотрены лишь наиболее общие ас­пекты этой актуальной проблемы для того, чтобы показать, что ее решение це­ликом основано на радиобиологических принципах, учитывающих, прежде всего связь эффекта с дозой облучения, вре­менем воздействия и клеточно-кинетическими параметрами облучаемых орга­нов и систем. С детальным рассмотрением этих вопросов можно ознакомиться в монографии Д. П. Осанова и И. А. Лихтарева (1977), которая, с любезного разрешения послужила основой данной главы.

Радиоактивные вещества могут поступать в организм тремя путями: с пищей и водой в желудочно-кишечный тракт, через легкие и кожу. Наиболее важным и потенциально опасным является ингаляционное поступление радионуклидов. Этому способствует огромная дыхательная поверхность альвеол, площадь которой ~ 100 м2 (в 50 раз  больше, чем поверхность кожи).                         

Радиоактивность воздуха может быть обусловлена содержанием в нем радиоактивных газов или аэрозолей в виде пыли, тумана или дыма. Доля радионуклида, задержанная в дыхательной системе, зависит от размера частиц, минутного объема и частоты дыхания.    

Дальнейшая судьба отложившихся в дыхательных путях радионуклидов  также связана с размерами радиоактивных частиц, их физико-химическими свойствами и транспортабельностью в организме. Хорошо  растворимые вещества в основном быстро (в несколько десятков минут) резорбируются в кровеносное русло, а затем, в процессе обмена веществ, откладываются в определенных органах и системах организма или выводятся. Нерастворимые или слаборастворимые вещества, осевшие в верхних дыхательных путях, удаляются из них вместе со слизистой, после чего с большой вероятностью поступают в желудочно-кишечный тракт, где резорбируются кишечной стенкой. Частицы, осевшие в альвеолярной части легочной ткани, либо захватываются фагоцитами и удаляются, либо мигрируют в лимфатические узлы, освобождаясь из них в течение нескольких месяцев или лет.

При вдыхании нетранспортабельных и короткоживущих радионуклидов органы дыхания по лучевой нагрузке становятся критическими. Транспортабельные радиоактивные вещества с большим периодом полураспада в основном резорбируются в самой легочной ткани, а также частично заглатываются и попадают в кровеносное русло при всасывании из кишечника.

Второй по значимости путь — поступление радионуклидов с пищей  и водой. Питательные вещества наряду с фоновыми концентрациями естественных радиоактивных веществ могут быть загрязнены искусственными радионуклидами, которые из внешней среды по биологическим пищевым цепочкам попадают в сельскохозяйственные растения, организмы животных и, в конце концов, — в продукты питания. Дальнейшая судьба радиоактивных веществ зависит от их растворимости  в жидкой среде желудочно-кишечного тракта, характеризующейся в различных его участках разными показателями рН. Так, например, многие растворимые соединения нуклидов, редкоземельных и трансурановых элементов, в частности плутония, при щелочном рН кишечника превращаются в нерастворимые гидрооксиды. Возможно и обратное, когда относительно плохо растворимые в воде вещества в жидкой среде желудочно-кишечного тракта превращаются в растворимые компоненты, хорошо всасывающиеся в кровь через эпителий кишечника. Именно поэтому Международная комиссия по радиационной защите рекомендует отказаться от термина «растворимость», заменив его термином «транспортабельность». В организм поступает лишь некоторая часть попавших в кишечник радионуклидов, большая часть их проходит «транзитом» и удаляется из кишечника. Во  время нахождения радиоактивных веществ в пищеварительном тракте происходит облучение кишечника, причем короткопробежные α- или β-частицы облучают только его стенку, а γ-кванты достигают и других внутренних органов, расположенных в брюшной полости и грудной клетке.

Таким образом, в случае поступления радиоактивных веществ в организм с продуктами питания и водой, когда отдельные участки кишечника поглощают значительную часть энергии испускаемых частиц, желудочно-кишечный тракт становится критическим органом.

Здесь уместно дать расширенное толкование критического органа по сравнению с определением, данным при описании радиационных син­дромов, возникающих в условиях внешнего облучения.

Орган тела человека является критическим, если он: а) получа­ет наибольшую дозу или усваивает наибольшее количество радио­нуклидов; б) играет наиболее важную роль (или необходим) для нормального функционирования всего организма; в) обладает на­ибольшей радиочувствительностью, т. е. повреждается самой  низкой дозой облучения по сравнению с другими органами.

С учетом различий в радиочувствительности, наблюдающихся в пределах одного органа, а также неоднородности распределения доз в его отдельных участках, особенно сказывающемся на действии инкорпорированных радионуклидов, критическими могут оказаться отдельные участки органа или его клеточные популяции, например базальный слой эпидермиса в коже, эпителий крипт кишечника, бронхиальный эпителий и активные остеобласты скелета.

Наименее изучен путь поступления радиоактивных веществ через кожу, которая до недавнего времени считалась для них эффективным барьером, в связи с чем проникновением радионуклидов через неповрежденные покровы пренебрегали. Однако в последующем было установлено, что радионуклиды, как и другие вещества, в составе жидких и газообразных соединений проникают через кожу животных и человека достаточно быстро в измеримых, а иногда и в значительных количествах. Так, скорость проникновения в организм человека паров оксида трития и газообразного йода через неповрежденную кожу сравнима со скоростью проникновения этих веществ через дыхательные пути, а количество плутония, проникающее в организм вследствие загрязнения кожи его водорастворимыми соединениями, не меньше, чем при поступлении в желудок. При приеме радоновой ванны в течение 20 мин в организм проникает через кожу до 4 % Rn.

Проницаемость кожи резко увеличивается при воздействии многих химически активных веществ, например обезжиривающих растворителей, особенно при повреждении рогового слоя эпидермиса, играющего главную роль в барьерной функции кожи. В производственных  условиях из-за наличия трещин, царапин, ссадин реальная опасность поступления радионуклидов в организм через кожу возрастает.

Значительное влияние на интенсивность подкожного поглощения радионуклидов оказывают температура и влажность окружающей среды.

Радионуклиды, проникающие через кожные покровы, создают опасность облучения самой кожи и тех внутренних органов, куда они доставляются кровотоком. При оценке облучения кожи обычно ограничиваются определением дозы, получаемой базальным слоем эпидермиса, расположенным у человека на глубине 50—150 мкм, где сосредоточены стволовые и пролиферирующие клетки. Однако в последнее время становится очевидной важность учета облучений и более глубоких слоев кожи, в зоне гемо- и лимфомикроциркуляции, обеспечивающей нормальный обмен веществ в клетках эпидермиса.

Радиационные повреждения внутренних органов радионуклидов, проникшими через кожу, не отличаются по характеру от наблюдаемых при поступлении радиоактивных веществ через желудочно-кишечный тракт и через легкие и связаны, прежде всего, с дозой облучения и ее пространственным распределением.

«Судьба» поступивших в организм радионуклидов зависит от их свойств и  химической природы. Одни из них в виде растворов удаляются с мочой, другие могут быть задержаны в организме на различные сроки.

Существует три основных типа распределения радионуклидов в организме — скелетный, ретикулоэндотелиальный и диффузный. Скелетный тип характерен для нуклидов щелочноземельной  группы элементов —Са, Sr, Ba, Ra, накапливающихся минеральной части скелета, а также некоторых соединений плутония и тория, задерживающихся в костной ткани. Ретикулоэндотелиальное распределение присуще нуклидам редкоземельных элементов — Се, Рr, Рm, а также Zn, Th, Am и трансурановым элементам.  По диффузному типу распределяются щелочные элементы — К, Na, Cs, Rb, а также нуклиды Н, N, С, Ро и не­которых других элементов.

Известны отдельные случаи высокой избирательности распределения. Так, изотопы I накапливаются исключительно в щитовидной железе.

Очевидно, что «органотропные» радионуклиды опаснее диффузных, так как их концентрации в тканях, а, следовательно, и тканевые дозы при прочих равных условиях всегда имеют большую величину. (Здесь речь идет о поступлении в организм относительно небольших количеств радионуклидов, возможном в производственных условиях. В случае острой интоксикации, вызванной большими количествами радиоактивных веществ, диффузный  тип распределения приводит к острой лучевой болезни со всеми вытекающими последствиями.)

В  процессе транспорта радионуклиды задерживаются в тех тканях, в составе которых имеются стабильные элементы, аналогичные им по химическим свойствам. Так как химический состав важнейших органов и тканей человека в настоящее время изучен достаточно хорошо, с определенной вероятностью можно предсказать, в какие ткани или органы попадет тот или иной радионуклид.

Процесс перехода радионуклидов из межклеточной жидкости в газы завершается в течение определенного отрезка времени, истинное значение которого пока неизвестно, но, тем не менее, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что оно невелико. Так, плазма крови очищается от переходящих в скелет стронция и кальция за 4-10 ч. Йод обнаруживается в щитовидной железе уже через несколько минут после внутривенного введения, а полный переход его из крови в щитовидную железу заканчивается в течение 10—15 ч. Уран выводится из тока крови за 12 ч.

Кроме описанного макрораспределения радионуклидов в организме необходимо учитывать их микрораспределение в различных органах и тканях человека и животных. Методом авторадиографии было показано, что остеотропные элементы, такие, как Sr и Ra, накапливаются преимущественно в растущих участках трубчатых костей — метафизах и эпифизах, распределяясь там неравномерно и образуя так называемые горячие пятна. Локальные аналогичные неоднородности рас­селения отмечаются и для других радионуклидов, например для Pu и Th — в легких, скелете, печени; I — в щитовидной железе.

Неоднородность распределения излучателя в ткани влияет на характер распределения, величину и мощность тканевой дозы, что особенно существенно, если тканевые микроструктуры с повышенной концентрацией излучателя имеют высокую радиочувствительность, а пробеги испускаемых им частиц сравнимы с линейными размерами этих микроструктур.

Значительные неоднородности распределения тканевых доз наблюдаются вокруг радиоактивных частиц в органах дыхания, в  этом случае отношение Dmax/Dmin оказывается порядка нескольких сотен.

Следствием больших неоднородностей микрораспределения радионуклидов в ткани являются специфически формирующиеся  патологические процессы, например цирроз печени, очаги склероза в легких и изменения в  костной ткани, в том числе образование остеосарком.

В  радиобиологических   исследованиях  для количественной оценки уровня внутреннего облучения, как и в случаях внешнего воздействия, используют поглощенную дозу, выраженную в греях, учитывая коэффициенты ОБЭ. Однако следует помнить все ограничения применимости концепции ОБЭ, описанные выше. Применительно к воздействию инкорпорированных изотопов это особенно важно, ибо специфика внутреннего облучения, связанная с резко выраженной неравномерностью распределения инкорпорированных в излучателе энергии и интенсивности, затрудняет использование ОБЭ. Исключение  составляют случаи равномерного распределения радионуклидов во всех тканях организма или их накопления в органах, доступных для изолированного внешнего облучения.

При оценке малых уровней облучения, ограниченных областью радиационной защиты, используют эквивалентную дозу, рассчитываемую  с помощью модифицирующих коэффициентов, учитывающих, прежде всего характерные для инкорпорированных изотопов специфические концентрационные и временные условия формирования тканевых доз.

Например, при инкорпорации радиоактивных изотопов Р или Na, отличающихся относительно коротким периодом полураспада, равномерным распределением и достаточно жестким излучением, возникает типичная острая лучевая болезнь, не отличающаяся от развивающейся при внешнем общем облучении. При попадании органотропных радионуклидов в организм разыгрываются различные варианты лучевого поражения с преимущественными проявлениями в тканях (где дозовая нагрузка максимальна), которые в этом случае становятся критическими.

Существенная особенность поражений при внутреннем облучении состоит в том, что особую опасность в таких случаях приобретают радионуклиды тяжелых элементов, испускающие не только β-, но и α-частицы. Обладая высокой ОБЭ, эти излучения, несмотря на малую проникающую способность, вызывают тяжелые повреждения эндотелия и эпителия, воздухоносных путей и кишечника, в которых они теряют весь запас своей энергии.

Другая особенность биологического действия инкорпорированных излучений определяется тем, что в отличие от внешнего облучения, при котором роль организма пассивна, при внутреннем облучении организм играет активную роль в формировании тканевых доз из-за наличия транспортных и метаболических процессов, обусловливающих накопление и выведение радионуклидов из определенных органов и тканей. Существуют трудности, связанные с дозиметрией излучения инкорпорированных изотопов, главной задачей которой является исследование пространственного и временного распределения поглощенной дозы на основе количественного описания кинетики распределения концентрации радионуклидов по всем тканям и органам и с учетом ЛПЭ. Решение этой задачи, как справедливо указывают Д. П. Осанов и А. Лихтарев (1977), возможно только при условии теоретического и экспериментального определения количества радионуклидов в организме и кинетики их поведения в зависимости от анатомических и физиологических особенностей организма в целом и его отдельных тканей, органов и систем с учетом их цитокинетических характеристик.

Наибольшее практическое значение имеет изучение различных аспектов биологического действия различных инкорпорированных радионуклидов, попадающих в организм человека в профессиональных условиях. Наряду с этим, однако, в чрезвычайных обстоятельствах военного времени, а также в аварийных случаях в результате взрыва ядерного устройства может возникнуть поражение попавшими в организм продуктами ядерного деления (ПЯД). Согласно обзору И. Я. Василенко (1981) клиника и патогенез таких поражений имеют свои особенности.

Продукты ядерного деления представляют собой смесь более чем 200 радиоактивных изотопов 36 элементов средней части (от Zn до Gd) периодической системы Менделеева. Поступая в организм, они в процессе обмена заменяют стабильные элементы и при распаде образуют нуклиды соседних групп периодической системы. Такие трансмутационные эффекты, а также возможность химических перестроек в результате радиоактивной отдачи, происходящей при эмиссии β-частиц и нейтронов, определяют некоторое своеобразие биологического действия ПЯД, которое в основном зависит от дозы, поглощенной органами преимущественного распределения радионуклидов, а также времени их полураспада и скорости выведения.

 

 

Половины споров не существовало бы, если бы люди договорились об определениях.

Р. Декарт

 

ОПОСРЕДОВАННЫЕ ЭФФЕКТЫ ОБЛУЧЕНИЯ. НАРУШЕНИЕ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ И ИЗМЕНЕНИЯ В НЕКРИТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ОРГАНИЗМА

 

§8 Опосредованные эффекты облучения и их роль в исходе поражения организма

 

Независимо от конкретных механизмов первичная реакция, развивающаяся при общем облучении или при массированном облучении определенных сегментов тела, также не может быть объяснена повреждением критических систем и требует признания ее опосредованного или дистанционного характера.

Не поддаются объяснению и локальные тканевые реакции, например ранняя преходящая эритема кожи, развивающаяся совершенно независимо от повреждения эндотелия сосудов и тем более от повреждения клеток кожи, так как она появляется задолго до этих изменений.

Все это свидетельствует о том, что в облученном организме серьезные повреждения одних тканей и систем неизбежно вызывают реактивные или взаимосвязанные изменения в других, относительное значение которых в патогенезе и исходе поражения нуждается каждый раз в оценке, учитывающей его конкретные особенности.

Наличие опосредованных радиационных влияний требует учета их определенного участия в любых лучевых реакциях, включая реакции клеточных популяций, подвергающихся локальному облучению в организме и находящихся под контролем его регулирующих систем и гуморальных факторов. Отсюда возникает задача расчленения непосредственного и опосредованного компонента в реакциях организма на облучение на всех уровнях организации, решение которой усложняется по мере усложнения объекта облучения.

Далеко не просто отнести многочисленные функциональные, биохимические и даже структурные нарушения органов и тканей к той или иной категории непосредственных или опосредованных реакций в организме. Во многих случаях эти вопросы пока еще являются предметом дискуссии и дальнейшего изучения. Останавливаясь лишь на отдельных сторонах данной проблемы, прежде всего во избежание недоразумений в понимании ее сути, необходимо коротко рассмотреть вопросы терминологии.

Иногда непосредственные и опосредованные эффекты ионизирующих излучений обозначают соответственно как прямое и непрямое или первичное и вторичное действие. Использование этих терминов для обозначения непосредственных и опосредованных лучевых реакций нецелесообразно, так как в радиобиологии им придается другой, физико-химический смысл.

Кроме того, опосредованное влияние ионизирующих излучений часто называют дистанционным, поскольку во многих случаях вызываемые ими эффекты проявляются вне облученных тканей.

(В иностранной литературе этому термину соответствует выражение abscopal effect (от лат. ab — приставка, обозначающая удаление; scopos – цель, мишень.)

Однако, по мнению А. Г. Свердлова, много лет занимающегося данной проблемой, эти понятия нельзя считать синонимами. Их значения могут совпадать, если рассматривать изменения вне облученного поля, ибо в этом случае опосредованное влияние одновременно является и дистанционным. Повреждение же облученных клеток и тканей может быть не только непосредственным, но и опосредованным, совсем не будучи дистанционным или, являясь интегральной реакцией, включает дистанционное влияние в качестве одного из компонентов.

«Иными словами, дистанционное действие всегда опосредованное, но опосредованное не всегда дистанционное. Термин «опосредованное» действие радиации более выражает сущность описываемого явления и поэтому заслуживает предпочтения» (А. Г. Свердлов, 1968).

Одним из распространенных способов выявления опосредованных, а именно дистанционных эффектов ионизирующих излучений, является локальное облучение какого-либо сегмента тела с последующим срав­нительным наблюдением за состоянием системы кроветворения в облученном и экранированном участках.

Как показали результаты экспериментов, проведенных на  животных разных видов, гибель и исчезновение клеток костного мозга происходят не только в облученных, но и в экранированных       зонах, однако в последних они выражены в значительно меньшей степени.

Рис. III.51. Динамика клеточного опустошения костного мозга крыс, подвергнутых субтотальному (одна конечность экранирована) рентгеновскому   облучению в дозе 10 Гр (по А. Л. Выгодской, 1967):

1 - облученный костный мозг, 2 - экранированный костный мозг, 3 – костный мозг при мнимом облучении (контроль)

 

На рис. III.51 приведена динамика опустошения костного мозга крыс в течение первых 48 ч после облучения, изученная на 300 животных. В экранированном участке наблюдалось уменьшение общего числа клеток костного мозга уже через 1,5 – 3 час после облучения; эффект достигал максимума (~ 25 %) к шестому часу и сохранялся на этом уровне до конца наблюдения. 

Не исключено,— что в первые 3 ч значительная часть эффекта является результатом стресса, вызванного самой процедурой облучения, о чем свидетельствуют результаты специальных опытов, проведенных на 190 крысах, подвергнутых мнимому облучению с выполнением всех связанных с ним процедур (рис. III.51, кривая 3). Однако если влияние процедурного стресса и проявляется, то лишь в первые часы после воздействия: в поздние же сроки им можно пренебречь, ибо эффект мнимого облучения снижается к шестому часу, а через 24 ч число клеток костного мозга возвращается к норме.

При анализе изменений числа клеток разных ростков в экранированном участке костного мозга установлено, что причинами его опустошения являются: перераспределение отдельных форменных элементов, подавление процессов клеточного деления при продолжающемся выходе зрелых клеток на периферию и гибель наиболее радиочувствительных элементов (эритробластов, миелобластов и лимфоцитов).

Существуют и другие данные, свидетельствующие о дистанционном влиянии облучения на кроветворение: например, об увеличении числа клеток с хромосомными аберрациями в экранированном костном мозге мышей (Н.Ф. Баракина, М. Н. Янушевская, 1966), а также в костном мозге крыс после введения им экстракта из тканей облученных животных (Ю. М. Керкис и др., 1964). В экранированном костном мозге крыс наблюдали повышение ультрафиолетовой флуоресценции (С.Н. Александров, 1966). Весьма показательны эксперименты по обнаружению усиления нарушений в костном мозге и селезенке по различным биохимическим и морфологическим показателям при тотальном облучении по сравнению с локальным.

В настоящее время практически отсутствуют данные, свидетельствующие об опосредованном влиянии облучения на периферическую кровь. Имеющиеся суждения на этот счет основаны на неправильной интерпретации лимфопении, наблюдаемой при локальном облучении, которой без достаточных оснований приписывали дистанционную природу. На самом деле причина лимфопении в этих случаях определяется интерфазной гибелью лимфоцитов, проходящих с током крови в сосудах облучаемой зоны.

Приведенные данные о дистанционном действии ионизирующих излучений на кроветворение дают основание считать, что оно вносит какую-то долю в изменения, наблюдаемые и в облученных участках кроветворных тканей, а также при тотальном облучении. Об этом же свидетельствует усиление выраженности дистанционного влияния с увеличением объема облучаемых тканей. Следовательно, такие изменения правильнее назвать опосредованными, тем более что в их формировании принимают участие регулирующие системы организма, в первую очередь центральная нервная и эндокринная системы. Особенно это характерно для участия этих систем в формировании функциональной неполноценности кроветворения в отдаленные сроки после облучения.

Оценивая роль опосредованного компонента в общем эффекте лучевого поражения кроветворения, следует отвести ему лишь второстепенное значение. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов, показавшие резкое повышение выживаемости облученных животных при экранировании незначительных участков костного мозга или даже при ослаблении их поражения созда­нием аноксии, например наложением лигатуры на конечности. Следовательно, ведущую роль в лучевом, поражении кроветворения играют процессы, непосредственно протекающие в молекулах и микроструктурах облучаемых клеток.

К числу нарушений в некритических системах относятся различные проявления изменений со стороны ЦНС и органов чувств, эндокринной, иммунной, сердечно-сосудистой и пищеварительной (исключая тонкий кишечник) систем, органов выделения, системы дыхания, печени, костно-мышечной системы, органов размножения и других клеточных сис­тем, условно называемых некритическими, так как они не ответствен­ны за непосредственный исход лучевого поражения организма. Это не исключает, однако, их роли в процессах восстановления, а также в от­даленных последствиях облучения. Более того, во многих случаях та­кого рода нарушения приобретают решающее значение, в связи с чем, как было показано на многочисленных примерах, понятие радиоустойчивости в отношении этих систем следует понимать как достаточно условное.

Не случайно в последние годы резко повысилось внимание многих исследователей к нарушениям, возникающим в различных стабильных (в цитокинетическом отношении) высокодифференцированных тканях. Это и понятно, ибо теперь, когда большое число вопросов патогенеза острого лучевого синдрома изучено достаточно подробно, выявились «белые пятна» в результате своеобразных «находок» как в эксперименте, так и в клинике, свидетельствующих о весьма существенных для орга­низма нарушениях, «неожиданно» возникающих в той или другой «нерадиочувствительной» системе.

Такие «находки» в виде функциональных нарушений обнаружены практически во всех органах и системах животных и человека (речь не идет о стойких органических поражениях, обнаруживаемых в позд­ние сроки: нефросклерозе, пневмосклерозе и др.). Поэтому здесь будут приведены лишь примеры нарушений в сердечно-сосудистой системе (к которой привлечено особое внимание в связи с развитием радиоангиокардиологии).

В нескольких докладах на V Международном конгрессе по радиациоционным исследованиям было обращено внимание на возникновение ранних изменений в сердце и сосудах. В одном из докладов было показано, что при γ-облучении перфузируемых препаратов сердца кроликов сокращаемость миокарда подавлялась, начиная с дозы 9 Гр. а кровоток в коронарных сосудах уменьшался уже при дозе 3 Гр; по достижении дозы 17 Гр изучаемые показатели снижались на 48 и 61 % соответственно.

В другом докладе были показаны два типа механических реакций на облучение, возникающих в сосудах. 1. Немедленный ответ (латентное время - несколько секунд) — тонические мышечные сокращения, обратимые через несколько минут (в аорте крыс и лягушек) и полуобратимые (в аорте кролика) при дозах 2,5—10 Гр, а при дозах 10—30 Гр — немедленная обратимая релаксация почечной артерии крыс и кроликов. 2. Поздние (латентное время — несколько мин) и очень медленные (максимум после 1 ч и более) тонические сокращения с большой продолжителъностью (> 3 ч) аорты и легочной артерии морских свинок, голубей и цыплят после облучения в дозе ~ 30 Гр,

Было также сообщено о развитии отечности мышечной стенки аорты у кроликов (после облучения в дозах 8 и 10 Гр; регистрация с помощью световой микроскопии), предшествовавшей другим видимым изменениям; затем в основном веществе появлялись дискретные кальциевые гранулы, число и размеры которых со временем увеличивались. Электронно-микроскопически обнаруживались изменения в vasa vasorum, дегенерация мышечных клеток, кальцификация миофибрилл.

Чрезвычайно показательны данные клинических наблюдений за больными лимфогранулематозом (81 человек), подвергавшимися ежедневному γ-облучению 60Со в области грудной клетки (средняя доза на область сердца за 22—35 сеансов ~ 45 Гр).

В 92% случаев через 12 мес после окончания лечения появились симптомы выпотного перикардита, причем у 24 больных выпот в перикарде был обнаружен рентгенологически. 11 больным была проведена катетеризация отделов правой половины сердца для подтверждения наличия выпота. У 14 больных выпот был преходящим, пяти больным из 11 произведено рассечение перикарда из-за тампонады сердца. Механизмы появления пострадиационного перикардита остались невыясненными.

Внимание к изменениям сердечно-сосудистой системы, как и других высокодифференцированных органов и систем, особенно ЦНС и эндокринной системы, впервые было привлечено советскими исследователями. Это самые ранние работы И. Ф. Тарханова и последующие широко известные экспериментальные исследования Л. А. Орбели, А. В. Лебединского,  П. Д. Горизонтова,  М. Н. Ливанова, Н. Н. Лифшиц, Ю. Г. Григорьева, Е. И. Воробьева, С. Н. Александрова, а также клинические наблюдения М. И. Неменова, М. П. Домшлака, А. К. Гуськовой и другие работы, посвященные проблеме нарушения в регулирующих системах и соматическим эффектам облучения.

Изменениям, которые происходят в иммунной системе, занимающей промежуточное место между критическими и некритическими системами организма, принадлежит особая роль в патогенезе лучевой болезни. Частично они рассматривались, например, при анализе причин инфекционных осложнений, а такие, как временная толерантность (вследствие массовой гибели лимфоцитов, являющихся иммунокомпетентными клетками), будут рассмотрены при описании основ трансплантационной терапии лучевого синдрома.

Наиболее демонстративным проявлением радиационного повреждения иммунитета признаны иммунодефицит и повышение чувствительности к возбуди­телям инфекционных заболеваний, сопровождающиеся количественными и ка­чественными изменениями нормальной микрофлоры организма, в частности кишечника.

Причинами иммунодепрессии и иммунодефицита, развивающихся вскоре после облучения, являются гибель, повреждение функции и миг­рационных свойств лимфоцитов, а также нарушение количественного соотношения субпопуляций лимфоцитов и их функциональных взаимо­действий. Как показали результаты работ А. А. Ярилина (1981), изу­чавшего клеточные механизмы действия радиации на иммунитет, нару­шение нормальных количественных соотношений субпопуляций лим­фоцитов обусловлено их различной радиочувствительностью: В-клетки более радиочувствительны, чем Т-клетки; Т2-лимфоциты и кортизончувствительные формы поражаются ионизирующей радиацией сильнее, чем, соответственно, Т1-лимфоциты и кортизонустойчивые. Однако численность В-клеток восстанавливается быстрее, чем числен­ность Т-клеток. В результате создающийся сразу после облучения относительный избыток Т-клеток сменяется периодом, когда иммунный ответ лимитирует их численность. Это определяет различную эффек­тивность введения Т- и В-клеток в разные сроки после облучения.

Основное проявление индуцируемого облучения миграционного де­фекта лимфоцитов, разумеется, кроме резкого уменьшения их числен­ности, состоит в нарушении способности выживших циркулирующих клеток проникать в лимфатические узлы. Нарушение миграции Т-лимфоцитов в лимфатические узлы — очень устойчивый радиационный эффект, вследствие которого замедляется темп восстановления числен­ности Т-клеток и уровня тимусзависимого ответа, что составляет при­чину позднего иммунодефицита.

Нормализация функции лейкоцитов осуществляется параллельно с восстановлением их численности и связана, вероятно, с замещением клеток, переживших облучение, вновь образованными. Параллельно с восстановлением функции Т- и В-клеток нормализуется их способ­ность к кооперации.

Значительно менее выражены клеточные нарушения иммунитета при местном облучении, в частности при лучевой терапии. В этом случае активно циркулирующие Т-клетки поражаются в большей степени, чем слабо рециркулирующие В-клетки, что легко объяснить, ибо наблюдающаяся лимфопения при локальных облучениях является следствием интерфазной гибели лимфоцитов, проходящих через зону облучения.

Таковы основные причины и механизмы клеточных аспектов иммунологической депрессии, возникающей после облучения.

Нарушение антимикробного иммунитета и связанные с ним инфекционные осложнения, кроме того, можно рассматривать как следствие повышения проницаемости тканевых барьеров, нарушения фагоцитарной способности клеток ретикулоэндотелиальной системы и угнетения неспецифических бактерицидных систем организма — пропердина, лизоцима, бактерицидных субстанций ряда тканей, а также бактерицидности кожи. Кроме того, облучение угнетает образование новых анти­тел, хотя почти не влияет на их продукцию, если проведено после иммунизации.

Большое значение имеют также развивающиеся в облученном организме аутоиммунные процессы, составляющие самостоятельную проблему неинфекционной иммунологии.

Аутоантигенами в принципе могут быть как нормальные ткани при их попадании в русло крови, где они обычно не встречаются, так и патологически измененные белки и связанные с ними вещества. После облучения создается реальная возможность столкновения организма с аутоантигенамн обоих видов вследствие быстро развивающейся тканевой деструкции, резкого повышения проницаемости биологических барьеров и изменения антигенных свойств тканей.              

На рис. III.52 представлена схема, иллюстрирующая возможные патологические сдвиги в облученном организме, связанные с изменением и циркуляцией тканевых антигенов. После облучения происходит утрата части нормальных антигенов и появление новых антигенных качеств. Кроме того, летальные повреждения клеток могут обусловить появление новых антигенных свойств белков вследствие постлетальных изменений. Потеря части нормальных антигенов, означающая утрату определенных структур, может быть причиной нарушения определенных функций клеток и органов. Это, а также клеточная деструкция и циркуляция в крови тканевых антигенов способствуют развитию токсемии. Кроме того, циркуляция в крови тканевых антигенов приводит к иммунологической перестройке организма — сенсибилизации и образованию антител двух родов — против денатурированных белков и против аутотканей. Уже в момент появления антигенной чужеродности измененные белки могут быть причиной патологической афферентной импульсации, которая в дальнейшем, воздействуя на хеморецепторы, обеспечивает патологическое влияние через нервную систему.

Таким образом, в настоящее время твердо установлены факты, характеризующие все этапы аутоиммунологических изменений в облученном организме: образование аутоантигенов, их циркуляцию, появление аутоантител и аутосенсибилизацию.

 

 

Рис. III.52. Последовательность процессов, связанных с измене­нием антигенных свойств тканей и циркуляцией тканевых ан­тигенов после облучения (по Р. В. Петрову, 1962)

 

Н. Н. Клемпарская, наиболее известный исследователь в этой области, отво­дит аутоаллергии ведущую роль в развитии лучевой болезни, которую она рас­сматривает как своеобразное аутоиммунное заболевание, характеризующееся выраженной направленностью реакций против распада собственных тканей в сто­рону сенсибилизации, что придает болезни особенно тяжелый характер и может, в частности, быть причиной развития некротических процессов и геморрагии. В подтверждение этой точки зрения приводится обширный экспериментальный материал, в том числе данные о профилактической и терапевтической эффектив­ности при лучевой болезни вакцинации и различных десенсибилизирующих средств.

Признавая несомненную роль аутоиммунных процессов в патогенезе непосредственных и отдаленных последствий облучения организ­ма, нельзя забывать о первопричинах острого лучевого синдрома, обусловленных клеточными утратами в критических системах клеточ­ного обновления.

Радиационные изменения, происходящие под влиянием облучения по существу во всех тканях, не могут не сказаться на обмене веществ. Как и другие разделы радиобиологии, и, пожалуй, в большей степени, радиационная биохимия (а именно она занимается этими вопросами) является самостоятельной областью знаний, здесь лишь будут намечены основные аспекты этой проблемы.

Обсуждая биохимические процессы в подвергнутом облучению организме, следует всегда иметь в виду их деление на две категории: биохимический этап в механизме первичного действия ионизирующих излучений и биохимические изменения, происходящие в организме при развитии лучевой болезни и ее отдаленных последствий.

О биохимическом этапе первичного действия ионизирующих излучений частично речь шла выше. Необходимо добавить, что следствием этих процессов, очевидно, следует признать такие важные цитологические события, как мутации, в частности разрывы хромосом, а также повреждения, приводящие к интерфазной гибели клеток.

О том, что разрыв хромосомы — значительно более сложное событие, чем механическое следствие прохождения ионизирующей частицы (нескольких частиц), свидетельствует хотя бы существование химического мутагенеза, биохимическая природа которого едва ли подлежит сомнению.

Свидетельством механического компонента хромосомного разрыва можно считать зависимость выхода хромосомных аберраций от ЛПЭ, хотя разрыв не обязательно происходит в месте прохождения частицы. Эти противоречия частично устраняются принятием гипотезы высвобождения ферментов вследствие радиационного нарушения внутриклеточных структур с последующей активацией ферментов и нарушением их пространственной координации.

Повреждение ядерных и других внутриклеточных мембран облегчает возможность ферментативной атаки ДНК. О важности и реальности феномена раннего повреждения мембран свидетельствуют оригинальные эксперименты Р. Бринкмана, показавшие, что нарушение проницаемости синовиальной оболочки и тонких слоев эпидермиса происходят при дозе 2 Гр уже в течение первой секунды после воздействия.

Однако этих примеров явно недостаточно для принятия какой-либо гипотезы, точно соответствующей последовательности биохимических процессов, вызывающих важнейшие для судьбы клетки события на молекулярном уровне.

Начиная с работ 40-х годов, и по сей день, известны данные о высокой радиочувствительности процесса биосинтеза ДНК. Существуют данные о нарушении самых ранних этапов синтеза предшественников ДНК — мононуклеотидов, фосфорилирования тимидинмонофосфата до тимидинтрифосфата, а также конечных этапов синтеза — полимеризации трифосфатов дезоксинуклеотидов на матрице.

Биосинтез РНК более резистентен, чем биосинтез макромолекул ДНК. По-видимому, радиационное угнетение биосинтеза РНК определяется не недостатком предшественников или снижением активности РНК-полимеразы, а опять же повреждением ДНК-матрицы вплоть до того, что она сама вызывает ингибирование активности этого фермен­та. Наиболее радиорезистентен процесс синтеза белка. Причем экс­периментальный материал в этом направлении получен в основном при работе с мечеными аминокислотами, включение которых в суммарные тканевые белки изучали спустя длительное время.

Одной из самых лабильных и рано ингибируемых биохимических систем является окислительное фосфорилирование, особенно в клетках радиочувствительных органов. Его разобщение в митохондриях селе­зенки отмечается в ближайший пострадиационный период при дозе 1 Гр. В ядрах клеток костного мозга, слизистой кишечника и лимфати­ческих узлах крыс через 1 ч после облучения фосфорилирование ингибируется или даже прекращается при дозах 0,25—0,5 Гр, а при дозе 1 Гр восстановление этого процесса происходит только через 5 сут. В радиорезистентных органах обратимое разобщение окислительного фосфорилирования наступает только при минимально летальных дозах.

Приведенных данных, однако, вовсе недостаточно, чтобы приписать и этому биохимическому процессу ведущую роль в определении радио­чувствительности, если учесть, что применение типичных разобщителей окислительного фосфорилирования, например динитрофенола, не оказывает радиосенсибилизирующего действия, а протекторы, напри­мер аминотиолы, угнетают этот процесс.

Перечисленные ранние нарушения основных биохимических про­цессов могут усиливаться в результате развития в ядре и цитоплазме вторичных процессов в ранние сроки после облучения. Например, на­копление некоторых метаболитов ДНК при активации процессов ката­болизма может привести к угнетению отдельных ферментативных реак­ций ее синтеза. Изменение проницаемости мембран, происходящее по­сле облучения, может повлечь за собой обеднение ядра ионами метал­лов или некоторыми важными метаболитами. Этот же процесс может привести к выходу в цитоплазму самых разнообразных, в том числе катаболических, ферментов.

Таким образом, регуляция обменных процессов после облучения на­рушается не только на молекулярном, но и на структурном уровне. Развиваясь, суммируясь и взаимно влияя друг на друга, эти процессы вызывают в разных тканях различные поражения. Это в свою очередь обусловливает возникновение межтканевых и межсистемных наруше­ний в организме, выражением которых и являются разнообразные на­рушения обмена веществ, наиболее общие, типичные из которых осо­бенно ярко проявляются в периоды разгара лучевой болезни и непосредственного восстановления.

Значительные нарушения белкового обмена определяются, прежде всего, процессами массовой клеточной деструкции радиочувствительных систем, сопровождающейся уже на ранних этапах повышенным содержанием азотсодержащих веществ в крови, а также выделением таурина (рис. III.53) и других аминокислот с мочой. Эти показатели наряду с анализом метаболитов нуклеинового обмена (например, дезоксицитидина) используют как раннюю диагностическую реакцию. О нарушении обмена белков свидетельствуют описанные выше угнетение выработки антител и других специфических иммунных белков, нарушение их антигенной структуры и т.п. Существуют данные об активации облучением многих ферментов — протеиназ, триптофаноксидазы, карбоксипепсидазы, щелочной и кислой фосфатаз, описано резкое усиление синтеза гемина и ослабление синтеза глобина (после кратковременной активности) в ретикулоцитах. Активация протеолитических ферментов, с которой в значительной степени связывают распад тканевых белков, в свою очередь, по-видимому, является не только следствием повышения проницаемости мембран клеточных органелл, но и результатом нарушения регуляции со стороны гипофизадреналовой системы.

Значительно более устойчив обмен углеродов, синтез которых если и нарушается, то только в поздние стадии лучевого поражения как результат глубокого патологического изменения органа, в котором он осуществляется. Наблюдаемые сдвиги в содержании гликогена в крови и печени в значительной степени связаны с нарушениями регуляции со стороны надпочечни­ков и частично с повреждением самих печеночных клеток (Б. М. Граевская, 1976). Относительно большой радиочувствительностью обладают высокополимерные полисахариды, выполняющие специальные функции во многих тканях и жидкостях организма. В частности, деполимеризация гиалуроновой  кислоты,  регулирующей проницаемость соединительной ткани, наступает рано и при сравнительно небольших дозах облучения (5—10 Гр). С деполимеризацией мукополисахаридов связывают резкое усиление диффузии введения в кожу различных красителей под влиянием облучения в дозах 1 Гр и выше.

 

Рис. III.53. Экскреция таурина (по Г. Каю, Дж. Энтерману, 1959):

1 — контрольные   крысы, 2 — после облучения в дозе I Гр, 3 — после облучения в дозе 6 Гр; вертикальной пунктирной линией отмечен момент облуче­ния

 

Большой интерес представляет изучение радиационных нарушений обмена липидов. Благодаря их легкой окисляемости, усиливающейся под действием облучения, образующиеся пероксиды участвуют в первичных пострадиационных процессах в форме органических радикалов. Это послужило основанием для детальных исследований роли нарушений липидного обмена в радиационной патологии (Б. Н. Тарусов, Н. М. Эмануэль, Ю. Б. Кудряшов, Е. Б. Бурлакова и др.).

Н. М. Эмануэлем, в частности, постулировались представления о значении свободнорадикальных процессов и их ингибировании природ­ными антиоксидантамн. Развивая эту концепцию, Е. Б. Бурлакова с соавторами (1975) показала, что в органах облу­ченных мышей антиокислительная активность резко снижается; на­пример, в селезенке через 24 ч после облучения в среднелетальных дозах она падает до нуля. При меньших дозах и в радиорезистентных органах падение антиокислительной активности выражено в меньшей степени.

Интересна интерпретация данных о радиационных изменениях липидов с учетом роли клеточных мембран. В последние годы наряду с известными меха­низмами регуляции клеточного метаболизма (репрессия — депрессия гена, аллостерическая регуляция ферментативной активности и система АМФ) большое внимание уделяется изучению регуляторной роли мембран. Структура и функция мембран, являющихся кооперативными системами, тесно связаны с составом и свойствами их основных компонентов: липидов и белков. Ряд авторов придает большое значение окислительным превращениям в липидах мембран как источ­нику изменения их функциональной активности, саморазборки и деградации. Е. Б. Бурлаковой с сотрудниками установлено, что в норме существует опреде­ленная взаимосвязь между изменениями состава липидов и скоростью окисли­тельных реакций. При усилении окислительных реакций липиды мембран обо­гащаются наиболее устойчивыми к окислению фракциями: сфингомиелином и фосфатидилхолином, а при торможении окислительных реакций — наиболее ла­бильными: фосфатидилсерином, фосфатидилинозитом и фосфатадилэтаноламином. Такого рода связь может рассматриваться как система, поддерживающая уровень окислительных реакций в стационарном состоянии.

При действии излучения наблюдаются уменьшение антиокислительной ак­тивности липидов, интенсификация окислительных реакций и связанное с ними изменение состава липидов мембран. В ранние сроки после облучения связь меж­ду скоростью окислительных реакций и составом липидов не отличается от нор­мы, однако, в последующем (например, через 3—5 сут после облучения мышей в дозах 5—6 Гр) эта взаимосвязь нарушается. Кроме того, изменение состава липидов мембран вызывает изменение ригидности мембраны, затрудняющее ее структурные перестройки и меняющее скорость ферментативных реакций, для кото­рых эти липиды являются эффекторами. Установлено, что изменение скорости ряда ферментативных реакций после облучения может быть объяснено характе­ром изменения относительной концентрации фосфолипидов — эффекторов для соответствующих ферментов. Изменение состава липидов мембран может изме­нять условия образования ДНК-мембранного комплекса, играющего важную роль в радиочувствительности и процессах восстановления после облучения. С этих молекулярно-биологических позиций находит свое объяснение связь антиокислительной активности липидов с радиочувствительностью, а так­же наличие корреляции между степенью изменения антиокислительной активности с помощью радиопротекторов и их защитным действием (Е. Б. Бурлакова, 1975).

Заключая раздел, нельзя не отметить, что облучение организма в летальных дозах вызывает очень незначительные изменения в общем обмене, развивающиеся в основном незадолго до гибели животного. Несмотря на структурные повреждения кишечника, всасывание продолжается без особых нарушений, а наблюдающиеся изменения во многом объясняются диспептическими расстройствами и потерей электролитов. Важно, однако, что наиболее твердо установленные факты, например серьезные нарушения нуклеинового обмена и антиокислительной активности, выражены более отчетливо в критических тканях.

В этой связи интересны обобщения, сделанные И. Н. Кендышем (1974) на основании анализа мировой литературы о биохимических механизмах радиобиологического эффекта на уровне организма. Автор справедливо критикует существующую в современной радиобиологии тенденцию рассматривать происхождение биохимических изменений с точки зрения универсальности действия радиации на процессы обмена веществ в различных системах организма и у разных объектов. И. Н. Кендыш рассматривает три категории изменений обменных процессов в облученном организме, происходящих в радиочувствительных и радиорезистентных тканях.

В радиорезистентных тканях (мышцы, головной мозг и др.) метаболические сдвиги невелики или отсутствуют, а в радиочувствительных тканях, клетки которых претерпевают интерфазную гибель уже через несколько минут после облучения, происходят существенные биохимические изменения, выражающиеся в ингибировании синтеза ДНК и активации аэробного гликолиза. Позднее нарушаются и другие метаболические процессы, которые являются следствием более грубых деструктивных изменений клеточной организации, сопутствующих предсмертному состоянию клеток; для этого периода характерны угнетение всех биосинтетических процессов и резкое усиление катаболизма с выделением различных клеточных компонентов.

В отличие от этого в печени облученных животных преобладает анаболический тип обменных сдвигов, выражающийся в усилении синтеза углеводов, липидов, белков и РНК. Анализируя результаты собственных исследований, автор считает, что активация биосинтеза основных метаболических субстратов в печени есть следствие регуляторных эффектов, вызываемых метаболитами радиочувствительных тканей, прежде всего аминокислотами.

Обобщая большой экспериментальный материал и литературные данные, И.Н. Кендыш (1974) приходит к заключению о том, что «... продукты распада радиочувствительных тканей, вступая во взаимодействие с различными структурами организма и, прежде всего с печенью, определяют ряд биохимических процессов, связанных единым происхождением или последовательностью метаболических реакций».

Согласно развиваемой концепции «между изменениями различных видов обмена в печени облученных животных существует взаимообусловленность, последовательность которой можно представить следующим образом. Аминокислоты, освободившиеся в радиочувствительных тканях вследствие их деструкции, подвергаются в печени дезаминированию и переаминированию и превращаются путем глюконеогенеза в глюкозу и гликоген. Избыточное количество новообразованной глюкозы поступает в кровь и с помощью инсулина вторично мобилизуется в печени и других тканях, где вовлекается в синтез гликогена путем гликонеогенеза. Эти процессы лежат в основе гипергликемии и увеличения содержа­ния гликогена в печени после облучения. Сопряженное с активизацией глюконео­генеза торможение гликолиза приводит к угнетению синтеза липидов из глюко­зы и компенсаторному усилению липогенеза из ацетата и жирных кислот с по­следующим выделением синтезированных липидов в плазму крови. Временная интенсификация синтеза липидов в жировой ткани из глюкозы обусловлена уси­лением глюконеогенеза в печени и ассимиляцией избытка периферической глю­козы. По такому же механизму, очевидно, усиливается липогенез в жировой тка­ни из ацетата и жирных кислот, которые в повышенном количестве образуются в печени, а затем утилизируются в жировой ткани. Накапливаясь в печени, сво­бодные аминокислоты индуцируют синтез белков плазмы крови и, возможно, син­тез ключевых ферментов глюконеогенеза — аминотрансфераз н некоторых дру­гих ферментов, контролирующих обмен аминокислот в печени. Развитие отрица­тельного азотистого баланса после облучения является следствием усиленной экскреции аминокислот, продуктов распада нуклеиновых кислот и других азо­тистых веществ, большое количество которых освобождается в радиочувстви­тельных тканях, но не ассимилируется организмом».

Разумеется, приведенная концепция нуждается в экспериментальной проверке. Привлекательность изложенных положений в том, что в их рамки «... укладывается весь основной комплекс пострадиацион­ных изменений углеводов, липидов, белков и нуклеиновых кислот. С этой точки зрения становится объяснимой фазность этих процессов, отражающая кинетику деструкции радиочувствительных тканей, трансформацию продуктов их распада в активные метаболиты и пере­ход их в общую циркуляцию. Таким образом, распад радиочувстви­тельных тканей можно рассматривать в качестве первичного звена пато­генетической цепи нарушений промежуточного обмена веществ при острой лучевой болезни». Тем самым сложную и запутанную картину наруше­ний биохимических процессов удается свести в стройную единую систе­му, отведя каждому из них свое место на разных этапах лучевого по­ражения.

Весьма вероятно, что остальные, в большинстве своем маловыра­женные биохимические нарушения играют определенную роль в меха­низме опосредованного и дистанционного действия облучения, состав­ляя основу его токсического компонента.

Понятие токсины или радиотоксины впервые было предложено П. Д. Горизонтовым (1958) для обозначения не каких-то определен­ных веществ, а самых различных не идентифицированных гумораль­ных агентов, возникающих в тканях под действием облучения. Будучи экстрагированы из тканей или оттекающих от облученных участков крови и лимфы, такие агенты при введении интактным животным вызы­вали у них разнообразные опосредованные и дистанционные проявле­ния лучевых реакций. Радиотоксинами могут быть как аномальные метаболиты, так и вещества, свойственные нормальному состоянию, но образующиеся в облученном организме в избыточном количестве, например гормоны, продукты обмена веществ и распада тканей, медиаторы и др. Речь не идет, таким образом, о каких-то специфических идентифицированных отдельных соединениях или о «первичных радиотоксинах», которым в рамках структурно-метаболической гипотезы приписывается роль инициаторов первичных процессов лучевого поражения.

Наиболее наглядно токсическая природа дистанционных эффектов в организме представлена при местном облучении. В этом случае выраженность их зависит как от объема, так и от локализации облученного участка, определяющих, с одной стороны, уровень и «качество» образующихся токсических метаболитов, а с другой—возможность их «разведения» в необлученных зонах организма. Кроме того, возникающие токсины воздействуют и на нейроэндокринный аппарат, что служит причиной ряда опосредованных эффектов, типичным примером которых можно считать упомянутое состояние рентгеновского «похмелья».

Часто можно встретить утверждения о том, что при общем облучении токсический компонент отсутствует или не играет никакой роли. Однако если признать роль радиотоксических факторов в развитии дистанционных и опосредованных эффектов при местном облучении (а для этого есть все основания), то нельзя отрицать, что те же факторы оказывают аналогичное влияние на организм и при общем облучении. Само собой разумеется, что относительное прогностическое значение их по сравнению с непосредственным действием излучения значительно меньше, но и его нельзя не учитывать. В частности, при лечении лучевой болезни следует помнить о необходимости мер, направленных на детоксикацию облученного организма — ранних кровопусканий с введением кровезаменителей, а также применения детоксикаторов, антигистаминных средств и др.

 

Что понимают под дистанционными и опосредованными эффектами облучения?

Как выявляется опосредованное действие облучения на систему кроветворения, и какова его роль в общем эффекте поражения этой системы?

В чем выражается радиационное нарушение иммунитета?

К чему сводятся основные нарушения обмена веществ в организме, возникающие под влиянием облучения?

Какова возможная роль токсинов (не смешивать с «первичными  токсинами») в дистанционных и опосредованных эффектах облучения?


 



[1] X – рентгеновское излучение